مختلف سپر ریزولوشن مائکروسکوپی تکنیکوں کا موازنہ
روایتی لائٹ مائکروسکوپی کے لیے، روشنی کا پھیلاؤ امیجنگ ریزولوشن کو تقریباً 250 nm تک محدود کرتا ہے۔ آج، سپر ریزولوشن تکنیک اس کو 10 سے زیادہ فیکٹر سے بہتر بنا سکتی ہے۔ یہ تکنیک بنیادی طور پر تین طریقوں سے حاصل کی جاتی ہے: سنگل مالیکیول لوکلائزیشن مائکروسکوپی، بشمول فوٹو سینسیٹو لوکلائزیشن مائیکروسکوپی (PALM) اور اسٹاکسٹک آپٹیکل ری کنسٹرکشن مائکروسکوپی (STORM)؛ ساختی الیومینیشن مائکروسکوپی (SIM)؛ اور محرک اخراج کمی مائکروسکوپی (STED)۔ سپر ریزولوشن ٹکنالوجی کا انتخاب کیسے کریں جس کی ہر کسی کو پرواہ ہے۔ "بدقسمتی سے، یہ فیصلہ کرنے کے لیے کوئی سادہ اصول موجود نہیں ہیں کہ کون سا طریقہ استعمال کیا جائے،" میتھیو سٹریسی، جو کہ آکسفورڈ یونیورسٹی، برطانیہ کے پوسٹ ڈاکٹرل محقق ہیں کہتے ہیں۔ "ہر ایک کے اپنے فوائد اور نقصانات ہیں۔" سائنس دان یقیناً یہ بھی معلوم کر رہے ہیں کہ کسی خاص منصوبے کے لیے صحیح طریقہ کا انتخاب کیسے کیا جائے۔ "بائیو امیجنگ کے تناظر میں، جن اہم عوامل پر غور کرنا ہے ان میں شامل ہیں: مقامی اور وقتی ریزولوشن، فوٹو ڈیمیج کی حساسیت، لیبلنگ کی گنجائش، نمونے کی موٹائی، اور بیک گراؤنڈ فلوروسینس یا سیل آٹولوگس فلوروسینس۔" یہ کیسے کام کرتا ہے مختلف سپر ریزولوشن خوردبین مختلف طریقوں سے کام کرتی ہیں۔ PALM اور STORM کے معاملے میں، فلوروسینٹ مارکروں کا صرف ایک چھوٹا سا حصہ ہی کسی خاص لمحے پرجوش یا فوٹو ایکٹیویٹ ہوتا ہے، جس سے ان کی آزاد لوکلائزیشن کو زیادہ درستگی کے ساتھ قابل بنایا جاتا ہے۔ تمام فلورسنٹ لیبلز کے ساتھ اس عمل سے گزرنے کے نتیجے میں ایک مکمل سپر ریزولوشن امیج بنتا ہے۔ اسٹیفن ہیل، کیمسٹری میں 2014 کا نوبل انعام جیتنے والوں میں سے ایک اور میکس پلانک انسٹی ٹیوٹ آف بائیو فزیکل کیمسٹری کے ڈائریکٹر نے کہا: "PALM/STORM سسٹم کو ترتیب دینا نسبتاً آسان ہے، لیکن اس کا اطلاق مشکل ہے، کیونکہ فلوروسینٹ گروپ میں فوٹو ایکٹیویشن کی صلاحیت ہونی چاہیے۔ حدود نقصان یہ ہے کہ انہیں سیل کے تناظر میں ایک واحد فلوروسینٹ مالیکیول کا پتہ لگانے کی ضرورت ہے، اور یہ STED سے کم قابل اعتماد ہیں۔" STED فلوروفور کو اکسانے کے لیے ایک لیزر پلس اور فلوروفور کو بجھانے کے لیے ایک انگوٹھی کی شکل کا لیزر استعمال کرتا ہے، جس سے سپر ریزولوشن کے لیے صرف درمیانی نینو میٹر سائز کا فلوروسینس رہ جاتا ہے۔ پورے نمونے کو اسکین کرنے سے ایک تصویر بنتی ہے۔ "STED کا فائدہ یہ ہے کہ یہ ایک پش بٹن ٹیکنالوجی ہے،" Hell نے وضاحت کی۔ "یہ ایک معیاری کنفوکل فلوروسینس مائکروسکوپ کی طرح کام کرتا ہے۔" یہ فلوروفورس جیسے سبز یا پیلے فلوروسینٹ پروٹین اور روڈامین سے ماخوذ رنگوں کا استعمال کرتے ہوئے زندہ خلیوں کی تصویر بھی بنا سکتا ہے۔ پیرامیٹرک موازنہ اگرچہ تمام سپر ریزولوشن تکنیکیں ریزولوشن کے لحاظ سے روایتی لائٹ مائکروسکوپی کو پیچھے چھوڑتی ہیں، لیکن وہ ایک دوسرے سے مختلف ہیں۔ سم تقریباً 100 این ایم ریزولوشن کو دوگنا کر دیتی ہے۔ PALM اور STORM 15 nm کے اہداف کو حل کر سکتے ہیں۔ Hell کے مطابق، STED زندہ خلیوں میں 30 nm اور مقررہ خلیوں میں 15 nm کی مقامی ریزولوشن فراہم کرتا ہے۔ جب بات مخصوص ایپلی کیشنز کی ہو تو ہمیں سگنل ٹو شور کے تناسب پر بھی غور کرنا چاہیے۔ بعض صورتوں میں، کم ریزولیوشن لیکن زیادہ SNR اس کے برعکس (اعلی ریزولیوشن لیکن کم SNR) کے مقابلے میں بہتر تصویر بن سکتی ہے۔ تصویر کے حصول کی رفتار بھی بہت اہم ہے، خاص طور پر زندہ خلیوں کے لیے۔ "تمام سپر ریزولوشن تکنیک روایتی فلوروسینس امیجنگ تکنیکوں کے مقابلے میں سست ہیں،" اسٹریسی نے کہا۔ "PALM/STORM سب سے سست ہے، اسے ایک تصویر حاصل کرنے کے لیے دسیوں ہزار فریموں کی ضرورت ہوتی ہے، SIM کو درجنوں فریموں کی ضرورت ہوتی ہے، اور STED ایک سکیننگ ٹیکنالوجی ہے، اس لیے حصول کی رفتار کا انحصار منظر کے میدان کے سائز پر ہوتا ہے۔" زندہ خلیات یا فکسڈ امیجنگ سیلز کے علاوہ، کچھ سائنسدان یہ بھی سمجھنا چاہتے ہیں کہ اشیاء کیسے حرکت کرتی ہیں۔ اسٹریسی زندہ خلیوں میں حیاتیاتی نظام کی حرکیات کو سمجھنے میں دلچسپی رکھتی ہے، نہ کہ صرف جامد تصاویر۔ وہ زندہ خلیوں میں حرکیات کا تجزیہ کرنے کے لیے PALM کو سنگل پارٹیکل ٹریکنگ کے ساتھ جوڑتا ہے۔ اس طرح، وہ مارکر مالیکیولز کو براہ راست ٹریک کر سکتا ہے جب وہ اپنے کام انجام دیتے ہیں۔ تاہم، اس کا خیال ہے کہ سم مالیکیولر سطح پر ان متحرک عملوں کا مطالعہ کرنے کے لیے موزوں نہیں ہے، لیکن اس کے حصول کی تیز رفتار ہونے کی وجہ سے، یہ خاص طور پر بڑے ڈھانچے جیسے پورے کروموسوم کی حرکیات کا مشاہدہ کرنے کے لیے موزوں ہے۔ تازہ ترین نتائج 2017 میں، ہیل کی ٹیم نے سائنس میں MINFLUX سپر ریزولوشن مائکروسکوپ کی اطلاع دی۔ جہنم کے مطابق، یہ سپر ریزولوشن طریقہ پہلی بار 1 nm کی مقامی ریزولوشن حاصل کرتا ہے۔ اس کے علاوہ، یہ زندہ خلیوں میں انفرادی مالیکیولز کو دوسرے طریقوں سے کم از کم 100 گنا زیادہ تیزی سے ٹریک کر سکتا ہے۔ دوسرے سائنسدانوں نے بھی MINFLUX مائکروسکوپ کے بارے میں بہت زیادہ بات کی۔ "نئی ایپلی کیشنز اور نقطہ نظر مسلسل تیار کیے جا رہے ہیں، لیکن دو پیش رفت میرے سامنے کھڑے ہیں،" Shechtman نے کہا. ایک MINFLUX ہے۔ "یہ انتہائی درست مالیکیولر پوزیشننگ حاصل کرنے کے لیے ایک ذہین طریقہ استعمال کرتا ہے۔" دوسری دلچسپ پیش رفت کے بارے میں، Shechtman نے اسٹینفورڈ یونیورسٹی میں WE Moerner اور ان کے ساتھیوں کا ذکر کیا۔ مورنر کیمسٹری میں 2014 کا نوبل انعام حاصل کرنے والا بھی تھا۔ جیتنے والوں میں سے ایک۔ فلوروسینٹ سنگل مالیکیولز کے انیسوٹروپک بکھرنے کی وجہ سے امیجنگ ریزولوشن کی حد کو دور کرنے کے لیے، سائنسدانوں نے مالیکیولز کی واقفیت اور پوزیشن کا تعین کرنے کے لیے مختلف اتیجیت پولرائزیشن کا استعمال کیا۔ اس کے علاوہ، انہوں نے نازک پتلی سطحوں کو تیار کیا ہے. یہ تکنیک ڈھانچے کو مقامی بنانے کی صلاحیت کو بہتر بناتی ہیں۔ فلوروسینٹ لیبلز کے بارے میں بہت سی سپر ریزولوشن ایپلی کیشنز میں، لیبل واقعی اہمیت رکھتے ہیں۔ کچھ کمپنیاں ایسی بھی ہیں جو متعلقہ مصنوعات فراہم کرتی ہیں۔ مثال کے طور پر، جرمنی کے Miltenyi نے Abberior کے ساتھ مل کر کام کیا ہے، ایک کمپنی جو Stefan Hell نے قائم کی تھی، تاکہ سپر ریزولوشن مائکروسکوپی رنگوں کے لیے حسب ضرورت اینٹی باڈی کنجوگیشن خدمات فراہم کی جا سکے۔ بہت سی دوسری کمپنیاں بھی مماثل مارکر پیش کرتی ہیں۔ "ہمارے نینو بوسٹر بہت چھوٹے ہیں، صرف 1.5 kDa، اور انتہائی مخصوص،" ChromoTek کے مارکیٹنگ آفیسر کرسٹوف ایکرٹ کہتے ہیں۔ یہ پروٹین سبز اور سرخ فلوروسینٹ پروٹین (GFP اور RFP) کو باندھتے ہیں۔ وہ الپاکا اینٹی باڈی کے ٹکڑوں سے اخذ کیے گئے ہیں، جنہیں VHH یا نینو باڈیز کے نام سے جانا جاتا ہے، بہترین پابند خصوصیات اور بیچ ٹو بیچ تغیر کے بغیر مستحکم معیار کے ساتھ۔ یہ مارکر مختلف سپر ریزولوشن تکنیکوں کے لیے موزوں ہیں جن میں SIM، PALM، STORM اور STED شامل ہیں۔ Ai-Hui Tang، یونیورسٹی آف میری لینڈ سکول آف میڈیسن کے ایک اسسٹنٹ پروفیسر، اور ساتھیوں نے اعصابی نظام میں معلومات کے پھیلاؤ کو دریافت کرنے کے لیے ChromoTek کے GFP-Booster اور STORM کا استعمال کیا۔ انہوں نے presynaptic اور postsynaptic نیوران میں مالیکیولر نانوکلسٹرز، جنہیں nanocolumns کہا جاتا ہے، پایا۔ سائنس دانوں کا خیال ہے کہ یہ ڈھانچہ ظاہر کرتا ہے کہ مرکزی اعصابی نظام Synaptic کارکردگی کو برقرار رکھنے اور ان کو منظم کرنے کے لیے سادہ اصولوں کو استعمال کرتا ہے۔ سپر ریزولوشن امیجنگ کے مختلف ورژن اور طریقوں کی بڑھتی ہوئی تعداد سائنسدانوں کو حیاتیاتی اسرار میں مزید گہرائی تک لے جا رہی ہے۔ نظر آنے والی روشنی کے پھیلاؤ کی حد کو توڑ کر، ماہرین حیاتیات خلیات کے اعمال کی "قریب سے نگرانی" بھی کر سکتے ہیں۔
