کنفوکل فلوروسینس مائکروسکوپی کا کام کرنے والا علم
کنفوکل فلوروسینس مائیکروسکوپی کا بنیادی اصول: فوکل ہوائی جہاز پر ایک چھوٹا، اچھی طرح سے طے شدہ روشنی کی جگہ بنانے کے لیے نمونہ کو روشن کرنے کے لیے ایک پوائنٹ لائٹ سورس کا استعمال کریں۔ روشن ہونے کے بعد اس جگہ سے خارج ہونے والے فلوروسینس کو معروضی عینک کے ذریعے جمع کیا جاتا ہے اور اصل الیومینیشن لائٹ پاتھ کے ساتھ ڈائیکروک آئینے میں لوٹا دیا جاتا ہے۔ ایک بیم سپلٹر تشکیل دیں. سپیکٹرومیٹر فلوروسینس کو براہ راست پکڑنے والے کو بھیجتا ہے۔ روشنی کے منبع اور پکڑنے والے کے سامنے ایک پن ہول ہوتا ہے، جسے بالترتیب الیومینیشن پن ہول اور ڈیٹیکشن پن ہول کہتے ہیں۔ دونوں کی ہندسی جہتیں یکساں ہیں، تقریباً 100-200nm; فوکل ہوائی جہاز پر روشنی کے نقطہ کی نسبت، دونوں ایک دوسرے سے جڑے ہوئے ہیں، یعنی روشنی کا نقطہ عینکوں کی ایک سیریز سے گزرتا ہے اور بالآخر ایک ہی وقت میں الیومینیشن پن ہول اور ڈیٹیکشن پن ہول پر فوکس کیا جا سکتا ہے۔ اس طرح، فوکل طیارے سے روشنی کو پتہ لگانے والے سوراخ کی حد کے اندر مرکوز کیا جا سکتا ہے، جب کہ فوکل طیارے کے اوپر یا نیچے سے بکھری ہوئی روشنی کو پتہ لگانے والے سوراخ کے باہر روک دیا جاتا ہے اور اس کی تصویر نہیں بنائی جا سکتی۔ نمونے کو لیزر کے ساتھ پوائنٹ بہ پوائنٹ سکین کیا جاتا ہے، اور پتہ لگانے والے پن ہول کے پیچھے فوٹو ملٹی پلیئر ٹیوب بھی متعلقہ لائٹ پوائنٹ پوائنٹ کی کنفوکل امیج بذریعہ پوائنٹ حاصل کرتی ہے، جسے ڈیجیٹل سگنل میں تبدیل کر کے کمپیوٹر پر منتقل کیا جاتا ہے، اور آخر میں جمع کیا جاتا ہے۔ پورے فوکل ہوائی جہاز کی ایک واضح کنفوکل امیج میں اسکرین۔ .
ہر فوکل ہوائی تصویر دراصل نمونے کا ایک نظری کراس سیکشن ہے۔ اس آپٹیکل کراس سیکشن کی ہمیشہ ایک خاص موٹائی ہوتی ہے اور اسے آپٹیکل پتلا سیکشن بھی کہا جاتا ہے۔ چونکہ فوکس پر روشنی کی شدت غیر فوکس پر روشنی کی شدت سے بہت زیادہ ہے، اور غیر فوکل ہوائی جہاز کی روشنی کو پن ہول سے فلٹر کیا جاتا ہے، اس لیے کنفوکل سسٹم کے فیلڈ کی گہرائی تقریباً صفر ہے۔ Z-axis سمت کے ساتھ اسکین کرنے سے آپٹیکل ٹوموگرافی کا احساس ہو سکتا ہے، جس سے نمونے کے مرکوز جگہ پر مطلوبہ دو جہتی آپٹیکل سیکشن کا مشاہدہ کیا جا سکتا ہے۔ XY طیارہ (فوکل طیارہ) اسکیننگ کو Z-axis (optical axis) اسکیننگ کے ساتھ ملا کر، دو جہتی تصاویر کی مسلسل سطحوں کو جمع کرکے اور خصوصی کمپیوٹر سافٹ ویئر کے ساتھ ان پر کارروائی کرکے، نمونے کی تین جہتی تصویر حاصل کی جاسکتی ہے۔
یعنی پتہ لگانے والا پن ہول اور لائٹ سورس پن ہول ہمیشہ ایک ہی نقطہ پر مرکوز ہوتے ہیں، تاکہ فوکس ہوائی جہاز کے باہر جوش میں آنے والا فلوروسینس پتہ لگانے والے پن ہول میں داخل نہ ہو سکے۔
لیزر کنفوکل کے کام کرنے والے اصول کا سادہ اظہار یہ ہے کہ یہ لیزر کو روشنی کے منبع کے طور پر استعمال کرتا ہے۔ روایتی فلوروسینس مائیکروسکوپ امیجنگ کی بنیاد پر، ایک لیزر سکیننگ ڈیوائس اور کنجوگیٹ فوکس کرنے والا آلہ شامل کیا جاتا ہے، اور ڈیجیٹل امیجز کو جمع کرنے اور اس پر کارروائی کرنے کے لیے سسٹم کو کمپیوٹر کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے۔
