سیل ریسرچ کے لیے خوردبینوں کی درجہ بندی اور کام کرنا
خوردبین خلیات کا مشاہدہ کرنے کا بنیادی آلہ ہے۔ روشنی کے مختلف ذرائع کے مطابق اسے دو قسموں میں تقسیم کیا جا سکتا ہے: نظری خوردبین اور الیکٹران خوردبین۔ سابقہ روشنی کے منبع کے طور پر مرئی روشنی کا استعمال کرتا ہے (یووی خوردبین الٹرا وائلٹ روشنی کا استعمال کرتی ہے)، جبکہ مؤخر الذکر الیکٹران بیم کو روشنی کے منبع کے طور پر استعمال کرتا ہے۔
-،نظری خوردبین
(1) عام نظری خوردبین
عام حیاتیاتی خوردبین تین حصوں پر مشتمل ہوتی ہیں، یعنی: ① روشنی کا نظام، بشمول روشنی کا منبع اور کنڈینسر؛ ② آپٹیکل میگنیفیکیشن سسٹم، معروضی لینس اور آئی پیس پر مشتمل ہے، جو خوردبین کا بنیادی حصہ ہے۔ کروی خرابی اور رنگین خرابی کو ختم کرنے کے لیے، آئی پیس اور مقصد دونوں ③ مکینیکل ڈیوائس، مواد کو ٹھیک کرنے اور مشاہدے کی سہولت کے لیے استعمال کیا جاتا ہے (شکل 2-1)۔
خوردبین کی تصویر واضح ہے یا نہیں اس کا تعین نہ صرف میگنیفیکیشن سے ہوتا ہے بلکہ اس کا تعلق خوردبین کی ریزولیوشن سے بھی ہوتا ہے۔ ریزولیوشن سے مراد خوردبین (یا انسانی آنکھ کا ہدف سے 25 سینٹی میٹر دور ہونا) کی قابلیت ہے تاکہ اشیاء کے درمیان سب سے چھوٹے فاصلے کو فرق کیا جا سکے۔ ریزولوشن کے سائز کا تعین روشنی کی طول موج اور یپرچر کے تناسب سے ہوتا ہے اور میڈیم کے ریفریکٹیو انڈیکس کو فارمولے سے ظاہر کیا جاتا ہے:
فارمولے میں: n=میڈیم کا ریفریکٹیو انڈیکس؛=یپرچر زاویہ (معروضی لینس یپرچر کے لیے نمونہ کا افتتاحی زاویہ)، NA=لینس یپرچر (عددی یپرچر)۔ لینس کا زاویہ ہمیشہ 180 ڈگری سے کم ہوتا ہے، لہذا sina/2 کی زیادہ سے زیادہ قدر 1 سے کم ہونی چاہیے۔
آپٹیکل لینس بنانے کے لیے استعمال ہونے والے شیشے کا ریفریکٹیو انڈیکس 1.65 سے 1.78 ہے، اور استعمال کیے جانے والے میڈیم کا ریفریکٹیو انڈیکس شیشے کے جتنا قریب ہے، اتنا ہی بہتر ہے۔ خشک آبجیکٹیو لینز کے لیے، میڈیم ہوا ہے، اور لینس کے یپرچر کا تناسب عام طور پر 0 ہے۔{6}}5 سے 0.95؛ آئل لینسز کے لیے دیودار کے تیل کو میڈیم کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے، اور لینس کے یپرچر کا تناسب 1.5 کے قریب ہو سکتا ہے۔
عام روشنی کی طول موج {{0}nm ہے، لہٰذا خوردبین کی ریزولوشن ویلیو 0.2μm سے کم نہیں ہوگی، اور انسانی آنکھ کی ریزولوشن 0.2mm ہے، لہذا عام خوردبین ڈیزائن کی زیادہ سے زیادہ اضافہ عام طور پر 1000X ہے۔
(2) فلوروسینس مائکروسکوپی
خلیات میں کچھ مادے، جیسے کہ کلوروفیل، الٹرا وائلٹ شعاعوں سے شعاع ہونے کے بعد فلوریسس ہو سکتے ہیں۔ کچھ مادے خود فلوروسینٹ نہیں ہوسکتے ہیں، لیکن اگر وہ فلوروسینٹ رنگوں یا فلوروسینٹ اینٹی باڈیز سے داغے ہوئے ہیں، تو وہ الٹرا وائلٹ شعاعوں سے شعاع ہونے پر بھی فلوروسیس ہوسکتے ہیں، اور فلوروسینس مائکروسکوپ (تصویر 2-2، 3، 4) ان آلات میں سے ایک ہے۔ ایسے مادوں پر معیار اور مقداری تحقیق کے لیے۔
فلوروسینس خوردبین اور عام خوردبین میں درج ذیل اختلافات ہیں:
1. روشنی کا طریقہ عام طور پر ایپی الیومینیشن ہوتا ہے، یعنی روشنی کے منبع کو معروضی لینس کے ذریعے نمونے پر پیش کیا جاتا ہے (شکل 2-3)؛
2. روشنی کا منبع بالائے بنفشی روشنی ہے، طول موج کم ہے، اور ریزولوشن عام خوردبینوں سے زیادہ ہے۔
3. دو خاص فلٹرز ہیں، روشنی کے منبع کے سامنے والا ایک نظر آنے والی روشنی کو فلٹر کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، اور آئی پیس اور آبجیکٹیو لینس کے درمیان والا ایک آنکھوں کی حفاظت کے لیے الٹرا وائلٹ روشنی کو فلٹر کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
(3) لیزر اسکیننگ کنفوکل مائکروسکوپ
لیزر کنفوکل اسکیننگ مائیکروسکوپ (لیزر کنفوکل اسکیننگ مائیکروسکوپ، شکل 2-5، 6) لیزر کو اسکیننگ لائٹ سورس کے طور پر استعمال کرتا ہے، اور امیجنگ پوائنٹ کو پوائنٹ، لائن بہ لائن، سطح بہ سطح اسکین کرتا ہے، اور اسکیننگ لیزر اور فلوروسینس کلیکشن ایک دوسرے کا اشتراک کرتا ہے۔ معروضی لینس، اور معروضی لینس کا فوکس ہے سکیننگ لیزر کا فوکل پوائنٹ بھی فوری امیجنگ کا آبجیکٹ پوائنٹ ہے۔ چونکہ لیزر بیم کی طول موج چھوٹی ہوتی ہے اور بیم بہت پتلی ہوتی ہے، اس لیے کنفوکل لیزر اسکیننگ مائکروسکوپ کی ریزولوشن زیادہ ہوتی ہے، جو کہ ایک عام آپٹیکل مائکروسکوپ سے تقریباً 3 گنا زیادہ ہے۔ نظام ایک بار مرکوز ہے اور اسکین نمونے کے ایک جہاز تک محدود ہے۔ جب توجہ مرکوز کرنے کی گہرائی مختلف ہو تو، نمونے کی مختلف گہرائی کی سطحوں کی تصاویر حاصل کی جا سکتی ہیں۔ یہ تصویری معلومات کمپیوٹر میں محفوظ ہوتی ہیں۔ کمپیوٹر کے تجزیے اور تخروپن کے ذریعے سیل کے نمونے کی سہ جہتی ساخت کو ظاہر کیا جا سکتا ہے۔
کنفوکل لیزر اسکیننگ مائیکروسکوپی کو نہ صرف سیل مورفولوجی کا مشاہدہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے بلکہ انٹرا سیلولر بائیو کیمیکل اجزاء کے مقداری تجزیہ، نظری کثافت کے اعدادوشمار اور سیل مورفولوجی کی پیمائش کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔
(4) ڈارک فیلڈ خوردبین
ڈارک فیلڈ مائیکروسکوپ (ڈارک فیلڈ مائکروسکوپ، فگر 2-7) میں کنڈینسر کے بیچ میں ایک لائٹ شیٹ ہوتی ہے، تاکہ روشنی کی روشنی براہِ راست انسانی لینس میں داخل نہ ہو، اور صرف روشنی ہی منعکس ہوتی ہے اور نمونے سے مختلف ہوتی ہے۔ معروضی لینس میں داخل ہونے کی اجازت ہے، اس لیے فیلڈ آف ویو کا پس منظر سیاہ ہے، اشیاء کے کنارے روشن ہیں۔ اس خوردبین کے استعمال سے، 4-200nm جتنے چھوٹے ذرات دیکھے جا سکتے ہیں، اور ریزولوشن عام خوردبین سے 50 گنا زیادہ ہو سکتا ہے۔
(5) فیز کنٹراسٹ خوردبین
P. Zernike کی طرف سے فیز کنٹراسٹ خوردبین (phasecontrast microscope، Figure 2-8, 9) کی ایجاد 1932 میں ہوئی تھی اور اس کے لیے 1953 میں فزکس کا نوبل انعام جیتا تھا۔ اس خوردبین کی سب سے بڑی خصوصیت یہ ہے کہ یہ غیر داغدار نمونوں اور زندہ خلیوں کا مشاہدہ کر سکتی ہے۔
فیز کنٹراسٹ مائیکروسکوپی کا بنیادی اصول نمونے سے گزرنے والی نظری روشنی کے نظری راستے کے فرق کو طول و عرض کے فرق میں تبدیل کرنا ہے، اس طرح مختلف ڈھانچوں کے درمیان تضاد کو بہتر بنانا اور مختلف ڈھانچوں کو واضح طور پر دکھائی دینا ہے۔ نمونے سے گزرنے کے بعد، روشنی ریفریکٹ ہوتی ہے، اصل نظری راستے سے ہٹ جاتی ہے، اور 1/4λ (طول موج) کی تاخیر ہوتی ہے۔ طول و عرض کو مضبوط کریں، بڑھائیں یا کم کریں، اس کے برعکس بڑھائیں۔ ساخت کے لحاظ سے، فیز کنٹراسٹ خوردبین میں دو خاص خصوصیات ہیں جو عام نظری خوردبین سے مختلف ہیں:
1. کنڈینسر ڈایافرام روشنی کے منبع اور کنڈینسر کے درمیان واقع ہے، اور اس کا کام یہ ہے کہ کنڈینسر سے گزرنے والی روشنی کو کھوکھلی روشنی کے شنک کی شکل دے اور نمونے پر توجہ مرکوز کرے۔
2. فیز پلیٹ (کنولر فیز پلیٹ) معروضی لینس میں میگنیشیم فلورائیڈ کے ساتھ لیپت ایک فیز پلیٹ کا اضافہ کرتی ہے، جو براہ راست روشنی یا منتشر روشنی کے مرحلے میں 1/4λ تک تاخیر کر سکتی ہے۔ دو قسمیں ہیں:
①A پلس فیز پلیٹ: براہ راست روشنی میں 1/4λ کی تاخیر ہوتی ہے۔ روشنی کی لہروں کے دو گروہوں کے یکجا ہونے کے بعد، روشنی کی لہریں ایک ساتھ شامل ہو جاتی ہیں، اور طول و عرض میں اضافہ ہوتا ہے۔ نمونہ کی ساخت ارد گرد کے درمیانے درجے سے زیادہ روشن ہے، ایک روشن کنٹراسٹ (یا منفی کنٹراسٹ) بناتی ہے۔
② B پلس فیز پلیٹ: پھیلی ہوئی روشنی میں 1/4λ کی تاخیر ہوتی ہے۔ شعاعوں کے دو سیٹوں کے یکجا ہونے کے بعد، روشنی کی لہروں کو گھٹا دیا جاتا ہے، اور طول و عرض چھوٹا ہو جاتا ہے، جس سے ایک تاریک کنٹراسٹ (یا مثبت کنٹراسٹ) بنتا ہے، اور ڈھانچہ ارد گرد کے میڈیم سے گہرا ہوتا ہے۔
