کنفوکل مائکروسکوپ اور عام آپٹیکل مائکروسکوپ کے درمیان موازنہ
جنرل آپٹیکل خوردبین
عام حیاتیاتی خوردبین تین حصوں پر مشتمل ہے، یعنی: ① روشنی کا نظام، بشمول روشنی کا منبع اور کنڈینسر؛ ② آپٹیکل ایمپلیفیکیشن سسٹم، جو معروضی لینس اور آئی پیس پر مشتمل ہوتا ہے، خوردبین کا بنیادی حصہ ہے۔ کروی خرابی اور رنگین خرابی کو ختم کرنے کے لیے، آئی پیس اور معروضی لینس دونوں پیچیدہ لینس گروپس پر مشتمل ہوتے ہیں۔ (3) مکینیکل ڈیوائس، فکسنگ میٹریل اور آسان مشاہدے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔
خوردبین کی تصویر واضح ہے یا نہیں اس کا انحصار نہ صرف میگنیفیکیشن پر ہے بلکہ خوردبین کی ریزولوشن پر بھی ہے۔ ریزولیوشن سے مراد خوردبین کی صلاحیت ہے (یا وہ جگہ جہاں انسانی آنکھیں ہدف سے 25 سینٹی میٹر دور ہیں) ذوئی کے چھوٹے وقفے کو الگ کرنے کے لیے۔ ریزولیوشن روشنی کی طول موج، یپرچر کے تناسب اور میڈیم کے ریفریکٹیو انڈیکس پر منحصر ہے، جس کا اظہار فارمولے سے ہوتا ہے:
R=0.61λ /N．A. N.A. n.sin/2
کہاں: n= میڈیم کا ریفریکٹیو انڈیکس؛=آئینے کا زاویہ (لینس کے یپرچر کے لیے نمونہ کا افتتاحی زاویہ)، اور NA= عددی یپرچر۔ آئینے کا زاویہ ہمیشہ 180 سے کم ہوتا ہے؟ لہذا، sina/2 کی زوئی قدر 1 سے کم ہونی چاہیے۔
آپٹیکل لینز بنانے کے لیے استعمال کیے جانے والے شیشے کا ریفریکٹیو انڈیکس 1.65~1.78 ہے، اور استعمال کیے جانے والے میڈیم کا ریفریکٹیو انڈیکس شیشے کے جتنا قریب ہے، اتنا ہی بہتر ہے۔ خشک مقصدی لینس کے لیے، میڈیم ہوا ہے، اور یپرچر کا تناسب عام طور پر 0 ہے۔{6}}5 ~ 0.95; تیل کا لینس خوشبودار اسفالٹ کو میڈیم کے طور پر استعمال کرتا ہے، اور لینس کھلنے کی شرح 1.5 کے قریب ہو سکتی ہے۔
عام روشنی کی طول موج 400~700nm ہے، لہٰذا خوردبین کی ریزولوشن 0.2μm سے کم نہیں ہے، اور انسانی آنکھ کی ریزولوشن 0.2mm ہے، لہٰذا زوئی کی بڑی میگنیفیکیشن عام خوردبین عام طور پر 1000X x ہے۔
آپ کو کنفوکل مائکروسکوپ کی ضرورت کیوں ہے؟
1. آپٹیکل مائکروسکوپ کو ہمارے عظیم پیشروؤں کی کوششوں اور بہتری کے ذریعے مکمل کیا گیا ہے۔ درحقیقت، عام خوردبین ہمیں آسانی سے اور جلدی سے خوبصورت خوردبین تصاویر فراہم کر سکتی ہیں۔ تاہم، ایک ایسا واقعہ جو اس تقریباً کامل خوردبین کی دنیا میں انقلابی اختراع لے کر آیا، وہ ہے "لیزر سکیننگ کنفوکل مائیکروسکوپ" کی ایجاد۔ اس نئے خوردبین کی خصوصیت ایک نظری نظام کو اپنانے سے ہے جو صرف ہوائی جہاز پر تصویری معلومات کو نکالتا ہے جہاں فوکس مرکوز ہوتا ہے، اور فوکس کو تبدیل کرتے ہوئے حاصل کردہ معلومات کو تصویری میموری میں بحال کرتا ہے، تاکہ مکمل سہ جہتی معلومات کے ساتھ ایک واضح تصویر بن سکے۔ حاصل کیا جا سکتا ہے. اس طریقہ سے، سطح کی شکل کے بارے میں معلومات جس کی تصدیق عام خوردبینوں سے نہیں کی جا سکتی ہے، آسانی سے حاصل کی جا سکتی ہے۔ اس کے علاوہ، عام نظری خوردبین کے لیے، "ریزولوشن کو بہتر بنانا" اور "فوکس کی گہرائی کو گہرا کرنا" متضاد حالات ہیں، خاص طور پر ہائی میگنیفیکیشن پر، لیکن کنفوکل خوردبین کے لیے، یہ مسئلہ حل ہو جاتا ہے۔
2. کنفوکال آپٹیکل سسٹم کے فوائد
کنفوکل آپٹیکل سسٹم نمونے کے نقطہ کو روشن کرتا ہے، اور منعکس روشنی بھی پوائنٹ ریسیپٹرز کے ذریعے موصول ہوتی ہے۔ جب نمونے کو فوکس پوزیشن میں رکھا جاتا ہے، تو تقریباً تمام منعکس شدہ روشنی فوٹو ریسیپٹر تک پہنچ سکتی ہے، لیکن جب نمونہ فوکس سے ہٹ جاتا ہے، تو منعکس شدہ روشنی فوٹو ریسیپٹر تک نہیں پہنچ سکتی۔ کہنے کا مطلب یہ ہے کہ کنفوکل آپٹیکل سسٹم میں، صرف وہی تصویر جو فوکس کے ساتھ ملتی ہے آؤٹ پٹ ہوگی، اور فکیولا اور بیکار بکھری ہوئی روشنی کو ڈھال دیا جائے گا۔
3. لیزر کیوں استعمال کریں؟
کنفوکل آپٹیکل سسٹم میں، نمونہ روشن ہوتا ہے اور منعکس روشنی بھی ایک پوائنٹ فوٹو ریسیپٹر کے ذریعے موصول ہوتی ہے۔ لہذا، نقطہ روشنی کا ذریعہ ضروری ہو جاتا ہے. لیزر ایک بہت ہی نقطہ روشنی کے منبع سے تعلق رکھتا ہے۔ زیادہ تر معاملات میں، کنفوکل مائکروسکوپ کا روشنی کا ذریعہ لیزر لائٹ ماخذ کو اپناتا ہے۔ اس کے علاوہ، لیزر کی خصوصیات، جیسے یک رنگی، براہ راست اور بہترین بیم کی شکل، بھی اس کے وسیع استعمال کی اہم وجوہات ہیں۔
4. تیز رفتار سکیننگ پر مبنی حقیقی وقت کا مشاہدہ ممکن ہو جاتا ہے۔
لیزر اسکیننگ میں، ایکوسٹک آپٹیکل ڈیفلیکٹر (AO پرائم عنصر) افقی سمت میں استعمال ہوتا ہے اور سروو گیلوانو-مرر عمودی سمت میں استعمال ہوتا ہے۔ چونکہ صوتی آپٹیکل ڈیفلیکشن یونٹ میں کوئی مکینیکل وائبریشن حصہ نہیں ہے، اس لیے یہ تیز رفتاری سے اسکین کرسکتا ہے، اور مانیٹرنگ اسکرین پر حقیقی وقت میں مشاہدہ کرنا ممکن ہے۔ اس کیمرے کی تیز رفتار ایک بہت اہم پروجیکٹ ہے جو توجہ مرکوز کرنے اور پوزیشن حاصل کرنے کی رفتار کو براہ راست متاثر کرتا ہے۔
5. فوکس پوزیشن اور چمک کے درمیان تعلق
کنفوکل آپٹیکل سسٹم میں، جب نمونے کو فوکس پوزیشن میں صحیح طریقے سے رکھا جاتا ہے، تو چمک بڑی ہوتی ہے، اور اس سے پہلے اور بعد میں، اس کی چمک تیزی سے گر جائے گی (شکل 4 میں ٹھوس لکیر)۔ فوکل ہوائی جہاز کی یہ حساس انتخاب کنفوکل مائکروسکوپ کی اونچائی کی سمت کی پیمائش اور فوکل کی گہرائی کو بڑھانے کا اصول بھی ہے۔ اس کے برعکس، عام آپٹیکل مائکروسکوپ میں فوکس پوزیشن سے پہلے اور بعد میں چمک کی واضح تبدیلی نہیں ہوتی ہے (شکل 4 میں ڈاٹڈ لائن)۔
6. ہائی کنٹراسٹ اور ہائی ریزولوشن
عام آپٹیکل مائکروسکوپ میں، فوکس سے ہٹنے والی منعکس روشنی مداخلت کرے گی، اور یہ فوکس امیجنگ والے حصے کے ساتھ اوورلیپ ہو جائے گی، اس طرح تصویر کے تضاد کو کم کر دے گی۔ اس کے برعکس، کنفوکل آپٹیکل سسٹم میں، فوکس سے باہر بکھری ہوئی روشنی اور معروضی لینس کے اندر بکھری ہوئی روشنی کو تقریباً مکمل طور پر ہٹا دیا جاتا ہے، اس لیے بہت زیادہ کنٹراسٹ والی تصویر حاصل کی جا سکتی ہے۔ اس کے علاوہ، کیونکہ روشنی دو بار معروضی لینس سے گزرتی ہے، اس لیے پوائنٹ امیج کو پہلے تیز کیا جاتا ہے، اور خوردبین کی ریزولوشن بھی بہتر ہوتی ہے۔
7. آپٹیکل لوکلائزیشن فنکشن
کنفوکل آپٹیکل سسٹم میں، فوکل پوائنٹ کے علاوہ کسی اور حصے کی منعکس روشنی کو مائیکرو پورس سے محفوظ کیا جاتا ہے۔ لہٰذا، تین جہتی نمونے کا مشاہدہ کرتے وقت، فوکس کے ساتھ نمونے کے ٹکڑے کرنے کے بعد اس طرح کی ایک تصویر بنتی ہے (شکل 5)۔ اس اثر کو آپٹیکل لوکلائزیشن کہا جاتا ہے، جس کا تعلق کنفوکل آپٹیکل سسٹم کی خصوصیات میں سے ایک ہے۔
8. توجہ مرکوز میموری تقریب منتقل
فوکس سے باہر کی نام نہاد منعکس روشنی کو مائکرو پورس کے ذریعے محفوظ کیا جاتا ہے۔ دوسری طرف، اس پر غور کیا جا سکتا ہے کہ کنفوکل آپٹیکل سسٹم کے ذریعے بننے والی تصویر کے تمام پوائنٹس فوکس کے ساتھ ملتے ہیں۔ لہذا، اگر سہ جہتی نمونے کو Z-axis (نظری محور) کی سمت کے ساتھ منتقل کیا جائے تو، تصویر کو جمع اور میموری میں محفوظ کیا جائے گا، اور zui آخر میں پورے نمونے اور فوکس کے اتفاق سے بننے والی تصویر حاصل کر لے گا۔ . اس طرح توجہ کی لامحدود گہرائی کے فنکشن کو موبائل میموری فنکشن کہا جاتا ہے۔
9. سطح کی شکل کی پیمائش کی تقریب
فوکس موونگ فنکشن میں، اونچائی ریکارڈنگ لوپ کو شامل کرکے نمونے کی سطح کی شکل کو غیر رابطہ طریقے سے ماپا جا سکتا ہے۔ اس فنکشن کی بنیاد پر، Z-axis کوآرڈینیٹس کو ریکارڈ کرنا ممکن ہے جو ہر پکسل میں زوئی کی بڑی چمکیلی قدر سے تشکیل پاتا ہے، اور اس معلومات کی بنیاد پر، نمونے کی سطح کی شکل سے متعلق معلومات حاصل کی جا سکتی ہیں۔
10. اعلی صحت سے متعلق مائکرو سائز کی پیمائش کی تقریب
روشنی وصول کرنے والا یونٹ ایک جہتی سی سی ڈی امیجنگ سینسر کو اپناتا ہے، لہذا یہ اسکیننگ ڈیوائس کے اسکیننگ جھکاؤ سے متاثر نہیں ہوسکتا، تاکہ اعلی درستگی کی پیمائش مکمل کی جاسکے۔ اس کے علاوہ، کیونکہ ایڈجسٹ ایبل فوکس ڈیپتھ کے ساتھ فوکس موونگ میموری فنکشن کو ایک ہی وقت میں اپنایا جاتا ہے، اس لیے فوکس آفسیٹ کی وجہ سے ہونے والی پیمائش کی غلطی کو ختم کیا جا سکتا ہے۔
11. تین جہتی تصویری تجزیہ
سطح کی شکل کی پیمائش کے فنکشن کا استعمال کرتے ہوئے، نمونے کی سطح کی سہ جہتی تصویر آسانی سے بنائی جا سکتی ہے۔ نہ صرف یہ، بلکہ کئی طرح کے تجزیے بھی کیے جا سکتے ہیں، جیسے: سطح کی کھردری پیمائش، رقبہ، حجم، سطح کا رقبہ، دائرہ، رداس، زوئی کی لمبائی، دائرہ، کشش ثقل کا مرکز، ٹوموگرافک امیج، ایف ایف ٹی ٹرانسفارم، لائن چوڑائی کی پیمائش اور اسی طرح.
لیزر کنفوکل سکیننگ مائیکروسکوپ کو نہ صرف سیل مورفولوجی کا مشاہدہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے بلکہ خلیوں میں حیاتیاتی کیمیائی اجزاء کے مقداری تجزیہ، نظری کثافت کے اعدادوشمار اور سیل مورفولوجی کی پیمائش کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے۔
