فلوروسینس خوردبین سے متعلق علم
کنفوکل فلوروسینس مائیکروسکوپی کا بنیادی اصول: نمونہ کو روشن کرنے کے لئے ایک نقطہ روشنی کا ذریعہ استعمال کیا جاتا ہے، اور فوکل ہوائی جہاز پر ایک اچھی طرح سے متعین چھوٹی روشنی کی جگہ بنتی ہے۔ splitters پر مشتمل ہے. بیم سپلٹر فلوروسینس کو براہ راست پکڑنے والے کو بھیجتا ہے۔ روشنی کے منبع اور پتہ لگانے والے کے سامنے ایک پن ہول ہے، جسے بالترتیب الیومینیشن پن ہول اور ڈیٹیکشن پن ہول کہتے ہیں۔ دونوں کا ہندسی سائز ایک جیسا ہے، تقریباً 100-200nm; فوکل ہوائی جہاز پر روشنی کی جگہ کے مقابلے میں، دونوں ایک دوسرے سے جڑے ہوئے ہیں، یعنی، روشنی کی جگہ لینز کی ایک سیریز سے گزرتی ہے، اور آخر میں ایک ہی وقت میں الیومینیشن پن ہول اور ڈٹیکشن پن ہول پر فوکس کیا جا سکتا ہے۔ اس طرح، فوکل طیارے سے روشنی کو پتہ لگانے کے سوراخ کے دائرہ کار میں تبدیل کیا جاسکتا ہے، جبکہ فوکل طیارے کے اوپر یا نیچے سے بکھری ہوئی روشنی کو پتہ لگانے والے سوراخ کے باہر روک دیا جاتا ہے اور اس کی تصویر نہیں بنائی جا سکتی۔ لیزر سیمپل پوائنٹ کو پوائنٹ کے حساب سے اسکین کرتا ہے، اور pinhole کا پتہ لگانے کے بعد فوٹوملٹیپلائر ٹیوب متعلقہ لائٹ پوائنٹ پوائنٹ کی کنفوکل امیج بھی بذریعہ پوائنٹ حاصل کرتی ہے، جسے ڈیجیٹل سگنل میں تبدیل کرکے کمپیوٹر پر منتقل کیا جاتا ہے، اور آخر میں ایک واضح شکل میں جمع کیا جاتا ہے۔ سکرین پر پورے فوکل ہوائی جہاز کی confocal تصویر۔
ہر فوکل پلین امیج دراصل نمونے کا آپٹیکل کراس سیکشن ہے، اور اس آپٹیکل کراس سیکشن کی ہمیشہ ایک خاص موٹائی ہوتی ہے، جسے آپٹیکل پتلا سیکشن بھی کہا جاتا ہے۔ چونکہ فوکل پوائنٹ پر روشنی کی شدت نان فوکس پوائنٹ پر اس سے کہیں زیادہ ہوتی ہے، اور نان فوکل پلین لائٹ پن ہول سے فلٹر ہوتی ہے، اس لیے کنفوکل سسٹم کے فیلڈ کی گہرائی تقریباً صفر ہے، اور Z کے ساتھ اسکیننگ -محور آپٹیکل ٹوموگرافی کو محسوس کر سکتا ہے، نمونے کے فوکسڈ جگہ پر دو جہتی آپٹیکل سیکشن کا مشاہدہ کرتا ہے۔ XY طیارہ (فوکل پلین) اسکیننگ کو Z-axis (optical axis) اسکیننگ کے ساتھ ملا کر، نمونے کی سہ جہتی تصویر کو مسلسل تہوں کی دو جہتی تصاویر کو جمع کرکے اور خصوصی کمپیوٹر سافٹ ویئر کے ذریعے پروسیس کیا جا سکتا ہے۔
یعنی پتہ لگانے والا پن ہول اور روشنی کا منبع پن ہول ہمیشہ ایک ہی نقطہ پر مرکوز ہوتے ہیں، تاکہ فوکل ہوائی جہاز کے باہر پرجوش فلوروسینس پتہ لگانے والے پن ہول میں داخل نہ ہو سکے۔
لیزر کنفوکال کے کام کرنے والے اصول کا سادہ اظہار یہ ہے کہ یہ لیزر لائٹ کو روشنی کے منبع کے طور پر استعمال کرتا ہے۔ روایتی فلوروسینس مائیکروسکوپ امیجنگ کی بنیاد پر، اس میں لیزر سکیننگ ڈیوائس اور کنجوگیٹ فوکسنگ ڈیوائس شامل کی گئی ہے، اور یہ کمپیوٹر کنٹرول کے ذریعے ڈیجیٹل امیج کے حصول اور پروسیسنگ کے لیے ایک نظام ہے۔
