مائکروبیل خلیوں کی شکل کو ایک خوردبین کے نیچے کیسے دیکھا جاتا ہے؟
مائیکرو اسکوپس ایسی مسکراہٹوں کو دیکھنے کے لیے ایجاد کی گئیں جنہیں ننگی آنکھ سے نہیں دیکھا جا سکتا۔ مائیکرو آرگنزم بہت چھوٹے ہوتے ہیں، لہٰذا انہیں خوردبین کی مدد سے بڑا کرنا اور ان کا مشاہدہ کرنا چاہیے۔ اس کے علاوہ، بہت سے قسم کے مائکروجنزم ہیں، لہذا بنیادی طور پر زیادہ تر نظری خوردبین مائکروجنزموں کا مشاہدہ کرسکتے ہیں. اگلا سوال یہ ہے کہ کس قسم کے مائکروجنزموں کے مشاہدے اور تجزیہ کے لیے کس قسم کی خوردبین کا استعمال کیا جانا چاہیے۔ عام خوردبین جو مائکروبیل مورفولوجی کا مشاہدہ کرنے کے لیے استعمال کی جا سکتی ہیں ان میں حیاتیاتی خوردبین، فیز کنٹراسٹ خوردبین، الٹی خوردبین، فلوروسینس خوردبین، کنفوکل خوردبین وغیرہ شامل ہیں۔
ذیل میں مائکروجنزموں کے مشاہدے کے لیے استعمال ہونے والی مختلف خوردبینوں کی وضاحت کی گئی ہے۔
1. عام نظری خوردبین قدرتی روشنی یا روشنی کو روشنی کے منبع کے طور پر استعمال کرتی ہے، اور اس کی طول موج تقریباً 0.4 μm ہے۔ خوردبین کی ریزولیوشن طول موج کا نصف ہے، یعنی 0.2 μm، اور ننگی آنکھ کو نظر آنے والی سب سے چھوٹی تصویر 0.2 ملی میٹر ہے۔ لہٰذا، 1000 بار میگنیفائی کرنے کے لیے تیل (ڈوبنے والے) آئینے کا استعمال 0.2μm ذرات کو ننگی آنکھ سے نظر آنے والے 0.2mm میں بڑھا سکتا ہے۔ عام نظری خوردبین کو بیکٹیریا، ایکٹینومیسیٹس اور فنگی کے مشاہدے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔
2. ڈارک فیلڈ مائکروسکوپی عام طور پر غیر داغدار مائکروبیل مورفولوجی اور حرکت کو دیکھنے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ ڈارک فیلڈ کنڈینسر کو عام خوردبین میں نصب کرنے کے بعد، روشنی درمیان سے براہ راست داخل نہیں ہو سکتی، اور منظر کا میدان تاریک ہے۔ جب نمونہ کنڈینسر کے کنارے سے ترچھی روشنی حاصل کرتا ہے، تو اسے بکھرا جا سکتا ہے، اس لیے سیاہ میدان کے پس منظر میں روشن مائکروجنزم جیسے بیکٹیریا یا اسپیروکیٹس کا مشاہدہ کیا جا سکتا ہے۔
3. فیز کنٹراسٹ مائیکروسکوپ فیز کنٹراسٹ مائکروسکوپ فیز فرق پلیٹ کے لائٹ اثر کا استعمال کرتا ہے تاکہ روشنی کے مرحلے اور براہ راست روشنی کے طول و عرض کو تبدیل کیا جاسکے، اور روشنی کے مرحلے کے فرق کو روشنی کی شدت کے فرق میں تبدیل کیا جاسکے۔ ایک فیز کنٹراسٹ خوردبین کے تحت، جب روشنی کسی غیر داغدار نمونے سے گزرتی ہے، روشنی کے مرحلے میں فرق نمونے کے مختلف حصوں کی کثافت کی عدم مطابقت کی وجہ سے ہوتا ہے، اور مائکروجنزموں کی شکل، اندرونی ساخت اور حرکت کے انداز کو دیکھا جا سکتا ہے۔
4. فلوروسینس مائکروسکوپ فلوروسینس مائکروسکوپ بنیادی طور پر عام آپٹیکل مائکروسکوپ کی طرح ہی ہے، بنیادی فرق روشنی کا ذریعہ، فلٹر اور کنڈینسر ہے۔ فی الحال، ان میں سے زیادہ تر ایپی لائٹ ڈیوائسز استعمال کرتے ہیں، اور ہائی پریشر مرکری لیمپ عام طور پر روشنی کے ذرائع کے طور پر استعمال ہوتے ہیں، جو الٹرا وائلٹ یا بلیو وائلٹ روشنی کا اخراج کر سکتے ہیں۔ فلٹرز کی دو قسمیں ہیں: اتیجیت فلٹر اور جذب فلٹر۔ عام روشن فیلڈ کنڈینسرز کے علاوہ، ڈارک فیلڈ کنڈینسرز کو فلوروسینس مائکروسکوپ میں بھی استعمال کیا جا سکتا ہے تاکہ فلوروسینس اور بیک گراؤنڈ کے درمیان تضاد کو بڑھایا جا سکے۔ یہ طریقہ فلوروسینٹ پگمنٹ سے داغے ہوئے یا فلوروسینٹ اینٹی باڈیز کے ساتھ مل کر بیکٹیریا کی کھوج یا شناخت پر لاگو ہوتا ہے۔
5. الیکٹران خوردبین الیکٹران کے بہاؤ کو روشنی کے منبع کے طور پر استعمال کرتی ہیں، اور طول موج نظر آنے والی روشنی سے دسیوں ہزار گنا مختلف ہوتی ہے، جو ریزولوشن کو بہت بہتر بناتی ہے۔ یہ مقناطیسی کنڈلی کو آپٹیکل ایمپلیفیکیشن سسٹم کے طور پر بھی استعمال کرتا ہے، اور میگنیفیکیشن دسیوں ہزار یا سیکڑوں ہزار بار تک پہنچ سکتی ہے۔ یہ اکثر وائرس کے ذرات اور بیکٹیریل الٹراسٹرکچر کے مشاہدے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔
غیر داغدار مائکروبیل نمونوں کا مشاہدہ:
غیر داغدار نمونوں کو عام طور پر بیکٹیریل مورفولوجی، طاقت اور حرکت کا مشاہدہ کرنے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ داغ نہ ہونے پر بیکٹیریا بے رنگ اور شفاف ہوتے ہیں، اور ان کا مشاہدہ بنیادی طور پر بیکٹیریا کے ریفریکٹیو انڈیکس اور ارد گرد کے ماحول کے درمیان فرق کی وجہ سے کیا جاتا ہے۔ فلاجیلا والے بیکٹیریا بھرپور طریقے سے حرکت کرتے ہیں، جبکہ فلاجیلا کے بغیر بیکٹیریا براؤنین کی بے قاعدہ حرکت دکھاتے ہیں۔ قابل عمل بیکٹیریا جیسے Treponema pallidum، Leptospira، اور Campylobacter میں مخصوص شکلیں اور حرکت کے نمونے ہوتے ہیں، جو تشخیصی اہمیت کے حامل ہوتے ہیں۔ عام طور پر استعمال شدہ طریقے ہیں پریشر ڈراپ کا طریقہ، پینڈنٹ ڈراپ طریقہ اور کیپلیری طریقہ۔
1. صاف مقعر شیشے کے مقعر کے سوراخ کے گرد ویزلین کو ہینگ ڈراپ طریقہ سے لگائیں، بیکٹیریل سسپنشن کی انگوٹھی لینے کے لیے ٹیکہ لگانے والے لوپ کا استعمال کریں اور اسے کور شیشے کے بیچ میں رکھیں، پھر مقعر شیشے کے مقعر کے سوراخ کو سیدھ میں رکھیں۔ کور شیشے کے بیچ میں قطرہ ڈالیں اور اسے ڈھانپیں، پھر اسے جلدی سے پلٹ دیں، کور شیشے کو ہلکے سے دبائیں تاکہ یہ مقعر کے سوراخ کے کنارے پر موجود ویزلین سے مضبوطی سے چپک جائے، اور ہائی میگنیفیکیشن مائکروسکوپ (یا تاریک میدان)۔
2. ٹیکہ لگانے والے لوپ کے ساتھ بیکٹیریل سسپنشن کی ایک انگوٹھی لیں اور اسے پریشر ڈراپ کے طریقہ سے صاف شیشے کی سلائیڈ کے بیچ میں رکھیں، اور بیکٹیریل سسپنشن کو آہستہ سے کور گلاس سے ڈھانپیں، اس بات کا خیال رکھتے ہوئے کہ بیکٹیریل سسپنشن کے بلبلوں اور زیادہ بہاؤ سے بچیں۔ . چند سیکنڈ کے لیے خاموش رہنے کے بعد، روشن میدان (یا تاریک میدان) میں ہائی پاور خوردبین کے نیچے مشاہدہ کریں۔
3. کیپلیری طریقہ بنیادی طور پر انیروبک بیکٹیریا کے حرکیات کی جانچ کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ عام طور پر 60~70ملی میٹر لمبا منتخب کریں۔ 05-1.0 ملی میٹر کے یپرچر کے ساتھ کیپلیری کے ذریعے اینیروبک بیکٹیریا کے سسپنشن کو سیفون کرنے کے بعد، کیپلیری کے دونوں سروں کو شعلے سے بند کریں۔ کیپلیری کو پلاسٹک کے کاغذ کے ساتھ شیشے کی سلائیڈ پر فکس کیا گیا تھا، اور تاریک فیلڈ میں ہائی پاور لینس کے نیچے دیکھا گیا تھا۔
خوردبین کے ساتھ داغدار مائکروبیل نمونوں کا مشاہدہ:
بیکٹیریا کے نمونے پر داغ لگنے کے بعد، بیکٹیریا اور ارد گرد کے ماحول کے درمیان رنگ میں شدید تضاد کی وجہ سے، بیکٹیریا کی مورفولوجیکل خصوصیات (جیسے سائز، شکل، ترتیب وغیرہ) اور کچھ خاص ڈھانچے (جیسے۔ جیسا کہ کیپسول، فلاجیلا، بیضہ وغیرہ) کو ایک عام نظری خوردبین کے تحت واضح طور پر دیکھا جا سکتا ہے، اور بیکٹیریا کی درجہ بندی کی جا سکتی ہے اور داغدار رد عمل کے مطابق ان کی شناخت کی جا سکتی ہے۔
(1) بیکٹیریل سٹیننگ کا عام طریقہ کار بیکٹیریل سٹیننگ کا عمومی طریقہ کار یہ ہے: سمیر (خشک کرنا)—فکسیشن—سٹیننگ۔
1. خون، رطوبت، اخراج، پنکچر سیال اور مائع کلچر، اور شیشے کی سلائیڈوں پر براہ راست پتلی فلم کے سمیر کی تیاری؛ پوسٹ مارٹم یا متاثرہ جانوروں کے ٹشوز، نمونے لینے کے لیے روئی کے جھاڑو سے زخم کو سمیر کریں۔ ٹھوس میڈیم پر بیکٹیریل کالونیوں یا لان کی تیاری کے لیے، سب سے پہلے عام نمکین کی انگوٹھی لینے کے لیے ٹیکہ لگانے والے لوپ کا استعمال کریں اور اسے شیشے کی سلائیڈ کے بیچ میں رکھیں، پھر تھوڑی مقدار میں کلچر لینے اور پیسنے کے لیے جراثیم سے پاک انوکیشن لوپ کا استعمال کریں۔ اسے عام نمکین میں یکساں طور پر، اسے 1 سینٹی میٹر 2 لیپت سطح پر پھیلائیں، اور اسے کمرے کے درجہ حرارت پر قدرتی طور پر خشک ہونے دیں یا کچھ فاصلے پر آہستہ آہستہ خشک ہونے دیں۔
2. فکسشن کا مقصد بیکٹیریا کو مارنا، بیکٹیریل پروٹین اور ساخت کو جمانا، اور داغ کو آسان بنانا ہے۔ دھونے کے دوران پانی سے دھونے سے بچنے کے لیے سلائیڈ پر قائم رہنے کے لیے بیکٹیریا کو فروغ دینا؛ بیکٹیریا کی پارگمیتا کو رنگوں میں تبدیل کریں، جو بیکٹیریل انٹرا سیلولر ڈھانچے کے داغ کے لیے فائدہ مند ہے۔ یہ عام طور پر شعلے کے ساتھ گرم کرکے طے کیا جاتا ہے، اور خشک سمیر تیزی سے 3 بار شعلے سے گزر جاتا ہے۔ سلائیڈ کو چھونے پر ہاتھ کی پشت پر جلد کو نہ جلانا بہتر ہے۔
3. خضاب لگانے کے مختلف معائنے کے مقاصد کے مطابق رنگنے کے لیے رنگنے کے مختلف طریقے منتخب کریں۔ رنگنے کے وقت، کوریج بڑھانے کے لیے ڈائی سلوشن کو ڈراپ وائز شامل کریں۔
4. مورڈینٹ کوئی بھی مادہ جو ڈائی اور رنگے ہوئے شے کے درمیان تعلق کو بڑھا سکتا ہے، رنگے ہوئے شے پر رنگ کو ٹھیک کر سکتا ہے اور خلیے کی جھلی کی پارگمیتا میں تبدیلی کا سبب بن سکتا ہے، اسے مورڈینٹ کہا جاتا ہے۔ عام طور پر پھٹکڑی، ٹینک ایسڈ، دھاتی نمکیات اور آیوڈین وغیرہ استعمال ہوتے ہیں اور رنگت کو فروغ دینے کے لیے حرارتی نظام کا بھی استعمال کیا جاتا ہے۔ مورڈینٹس کو پرائمری سٹیننگ اور کاؤنٹر سٹیننگ کے درمیان استعمال کیا جا سکتا ہے، اور فکسیشن کے بعد بھی استعمال کیا جا سکتا ہے یا فکسٹیو اور سٹیننگ میں شامل کیا جا سکتا ہے۔
5. ڈیکولرائزیشن کوئی بھی کیمیائی ایجنٹ جو رنگے ہوئے شے کے رنگ کو ختم کر سکتا ہے اسے ڈیکولرائزر کہا جاتا ہے۔ ایتھنول، ایسیٹون وغیرہ عام طور پر ڈیکولرائزر کے طور پر استعمال ہوتے ہیں۔ رنگ کاری کرنے والا ایجنٹ بیکٹیریا اور رنگوں کے امتزاج کے استحکام کی ڈگری کا پتہ لگا سکتا ہے، جس کا استعمال امتیازی داغ کے لیے کیا جا سکتا ہے۔
6. کاؤنٹرسٹیننگ بیکٹیریا یا ان کے ڈھانچے جن کو رنگین کر دیا گیا ہے اکثر آسانی سے مشاہدے کے لیے کاؤنٹر سٹین محلول کے ساتھ کاؤنٹر سٹین کیا جاتا ہے۔ کاؤنٹر اسٹیننگ محلول کا رنگ تیز کنٹراسٹ بنانے کے لیے بنیادی رنگنے والے محلول سے مختلف ہے۔ کاؤنٹر سٹیننگ زیادہ مضبوط نہیں ہونی چاہیے، تاکہ ابتدائی داغ کا رنگ چھپا نہ جائے۔
