لیزر کنفوکل مائکروسکوپ کی خصوصیات اور ایپلی کیشنز
جب کہ ایک عام خوردبین میں مشاہدے کی تصویری طیارہ ہمسایہ محوری طیاروں سے معروضی لینس کے فوکل طیارے کو ڈیٹیکٹر کے ساتھ اوورلیپ کر کے الگ تھلگ کر دیا جاتا ہے، ایک کنفوکل مائکروسکوپ میں یہ تنہائی نمونے کو ایک تفاوت محدود نقطہ کے ساتھ روشن کر کے حاصل کی جاتی ہے۔ اس تنہائی کو حاصل کرنے اور اس طرح ریزولوشن کو بہتر بنانے کے لیے روشنی کے اس نقطہ کے کنجوجٹ فوکس پر جمع روشنی کے راستے میں ایک پن ہول کا استعمال کرتے ہوئے روشنی اور فلٹرنگ آوارہ روشنی۔
صرف کنجوگیٹ نمونہ کی تہہ سے منعکس ہونے والی روشنی ہی کلیکشن لائٹ پاتھ میں پنہول سے گزر سکتی ہے، جبکہ باقی غیر متعلقہ نمونے کی تہہ کی عکاسی پن ہول کے ذریعے مسدود ہوتی ہے۔ اس سے ریزولوشن میں نمایاں اضافہ ہوتا ہے۔ ذیل میں دکھایا گیا ہے ایک ہی موٹے نمونے کی کثیر جہتی فلوروسینس مائکروسکوپی اور کنفوکل مائکروسکوپی کا ایک ساتھ ساتھ موازنہ۔ جب تصویروں کا ایک سلسلہ مختلف فوکل طیاروں پر لیا جاتا ہے، تو ایک تصویر تیار کی جاتی ہے جسے عام طور پر "z-stack" کہا جاتا ہے، جو confocal microscopy کے ذریعے فراہم کردہ ریزولوشن اور کنٹراسٹ حاصلات اور ان فوائد کی بنیادی وجوہات کو ظاہر کرتا ہے۔ یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ اسٹیک کے اوپری حصے پر موجود امیج کا جائزہ لینے سے جہاں امیجنگ طیارہ ٹشو کے اوپر ہوتا ہے فلوروسینس امیج میں بکھری ہوئی روشنی کی ایک بڑی مقدار کو ظاہر کرتا ہے، جب کہ کنفوکل مائکروسکوپ کی تصویر سیاہ دکھائی دیتی ہے۔ محوری سمت میں PSF میں یہ کمی براہ راست z-stack کے وسط میں آپٹیکل انٹرفیس پر مشاہدہ کردہ ریزولوشن میں فرق میں حصہ ڈالتی ہے۔
آپٹیکل سلائس اسکیننگ امیجنگ
لیزر اسکیننگ کنفوکل مائکروسکوپی کی ایک اور خصوصیت یہ ہے کہ یہ اسکیننگ امیجنگ تکنیک ہے۔ روایتی وسیع فیلڈ الیومینیشن تکنیک پورے نمونے کو روشن کرتی ہے تاکہ تصویر کو براہ راست ننگی آنکھ یا ڈٹیکٹر کے ذریعے پکڑا جا سکے، لیکن ایل ایس سی ایم نمونے کے ذریعے اسکین کرنے کے لیے روشنی کے ایک یا زیادہ فوکس شدہ شہتیروں کا استعمال کرتا ہے، تاکہ نتیجے میں آنے والی تصویر کو ایک یا زیادہ فوکس کیا جا سکے۔ آپٹیکل سلائس، جیسا کہ درج ذیل خاکہ میں دکھایا گیا ہے۔ روایتی وسیع فیلڈ الیومینیشن اور لیزر اسکیننگ کنفوکل الیومینیشن کے درمیان فرق ذیل میں دکھایا گیا ہے۔
لہذا، جدید کنفوکل مائیکروسکوپی کا ایک عملی طریقہ نیچے دی گئی تصویر میں دکھایا گیا ہے۔ لیزر سے جوش کی روشنی کو ڈیکروک آئینے سے گزارا جاتا ہے اور نمونے کی x- سمت اور y- سمت میں گیلوانومیٹر آئینے کے ایک جوڑے کے ذریعے اسکین کیا جاتا ہے، اور نمونے کا جوش (یا انعکاس) ایک پن ہول سے ہوتا ہوا PMT میں جاتا ہے۔ ڈٹیکٹر کو ریکارڈ کیا جائے گا، اور ریکارڈ شدہ سکین شدہ تصویر کو کمپیوٹر کے ذریعے دوبارہ بنایا جاتا ہے تاکہ نمونے کی اصل تصویر تیار کی جا سکے۔
