مائکروبیولوجیکل خوردبین براہ راست گنتی
تجرباتی اصول
ہیموکیٹو میٹر کا استعمال کرتے ہوئے خوردبین کے نیچے براہ راست گنتی ایک عام طور پر استعمال ہونے والا مائکروبیل گنتی کا طریقہ ہے۔ اس طریقہ کار کا فائدہ یہ ہے کہ یہ بدیہی اور تیز ہے۔ سلائیڈ اور ہیمو سائیٹومیٹر کے کور گلاس کے درمیان کاؤنٹنگ چیمبر میں مناسب طور پر پتلا ہوا بیکٹیریل سسپنشن (یا بیضہ معطلی) رکھیں اور مائیکروسکوپ کے نیچے شمار کریں۔ چونکہ گنتی کے چیمبر کا حجم طے شدہ ہے (0.1mm2)، اس کو خوردبین کے نیچے مشاہدہ کردہ مائکروجنزموں کی تعداد کے مطابق فی یونٹ حجم میں مائکروجنزموں کی کل تعداد میں تبدیل کیا جا سکتا ہے۔ چونکہ یہ طریقہ زندہ اور مردہ بیکٹیریا کا مجموعہ شمار کرتا ہے، اس لیے اسے کل بیکٹیریا گننے کا طریقہ بھی کہا جاتا ہے۔
ہیمو سائیٹومیٹر عام طور پر شیشے کی ایک خاص سلائیڈ ہوتی ہے جس پر چار نالی تین پلیٹ فارمز بناتے ہیں۔ درمیان میں موجود پلیٹ فارم کو ایک مختصر افقی نالی کے ذریعے دو حصوں میں تقسیم کیا گیا ہے۔ ہر طرف پلیٹ فارم پر ایک گرڈ کندہ ہے۔ ہر گرڈ کو نو بڑے چوکوں میں تقسیم کیا گیا ہے۔ درمیان میں بڑا مربع گنتی کا کمرہ ہے۔ مائکروجنزموں کو گنتی کے چیمبر میں شمار کیا جاتا ہے۔
گنتی کے کمرے کے پیمانے کی عام طور پر دو خصوصیات ہوتی ہیں، ایک یہ کہ ایک بڑے مربع کو 16 درمیانی مربعوں میں تقسیم کیا جاتا ہے، اور ہر درمیانی مربع کو 25 چھوٹے مربعوں میں تقسیم کیا جاتا ہے (تصویر Ⅷ-2)؛ دوسرا بڑا مربع ہے مربع کو 25 درمیانی مربعوں میں تقسیم کیا گیا ہے، اور ہر درمیانی مربع کو 16 چھوٹے مربعوں میں تقسیم کیا گیا ہے (تصویر Ⅷ-1، C)۔ لیکن اس سے کوئی فرق نہیں پڑتا ہے کہ گنتی کا بورڈ کس قسم کا ہے، ہر بڑے مربع میں چھوٹے مربعوں کی تعداد ایک جیسی ہے، یعنی 16×25=400 چھوٹے مربع۔
ہر بڑے مربع کی طرف کی لمبائی 1 ملی میٹر ہے، اور ہر بڑے مربع کا رقبہ 1 ملی میٹر ہے۔ کور گلاس کو ڈھانپنے کے بعد، سلائیڈ گلاس اور کور گلاس کے درمیان اونچائی 0.1 ملی میٹر ہے، اس لیے گنتی کے چیمبر کا حجم 0.1 ملی میٹر ہے۔
گنتی کرتے وقت، عام طور پر پانچ درمیانی مربعوں میں بیکٹیریا کی کل تعداد کو شمار کریں، پھر ہر درمیانی مربع کی اوسط قیمت حاصل کریں، اور پھر بڑے مربع میں بیکٹیریا کی کل تعداد حاصل کرنے کے لیے 16 یا 25 سے ضرب دیں، اور پھر اس میں تبدیل ہوجائیں۔ 1ml بیکٹیریل محلول میں بیکٹیریا کی کل تعداد۔
لیبارٹری کا سامان
Hemocytometer, microscope, coverslip, sterile capillary;
تجرباتی مواد
Saccharomyces cerevisiae suspension
تجرباتی طریقہ کار (مائکروبیل خوردبین براہ راست گنتی کا طریقہ)
1. کم کرنا
Saccharomyces cerevisiae suspension کو مناسب طریقے سے پتلا کریں۔ اگر بیکٹیریل محلول گاڑھا نہیں ہے تو اسے پتلا کرنے کی ضرورت نہیں ہے۔
2. خوردبین گنتی کا کمرہ
نمونے شامل کرنے سے پہلے، کاؤنٹنگ پلیٹ کے گنتی چیمبر کا ایک خوردبین معائنہ کریں۔ اگر گندگی ہے، تو اسے گننے سے پہلے صاف کرنے کی ضرورت ہے.
3. نمونہ شامل کریں
صاف اور خشک ہیمو سائیٹومیٹر پلیٹ کو کور گلاس سے ڈھانپیں، اور پھر ایک جراثیم سے پاک تنگ منہ والے ڈراپر کا استعمال کرتے ہوئے کور شیشے کے کنارے (زیادہ زیادہ نہیں) سے پتلے ہوئے Saccharomyces cerevisiae محلول کا ایک چھوٹا قطرہ گرائیں، تاکہ بیکٹیریا کا محلول محفوظ رہے۔ خلا کے ساتھ ساتھ خلا کے قریب ہے۔ کیپلیری اوسموسس خود سے گنتی کے چیمبر میں داخل ہوتا ہے، اور عام گنتی کے چیمبر کو بیکٹیریل مائع سے بھرا جاسکتا ہے۔ ہوشیار رہو کہ ہوا کے بلبلے نہ ہوں۔
4. خوردبین شمار
5 منٹ آرام کرنے کے بعد، ہیمو سائیٹومیٹر کو مائیکروسکوپ کے اسٹیج پر رکھیں، گنتی کے چیمبر کا مقام معلوم کرنے کے لیے پہلے کم طاقت والے لینس کا استعمال کریں، اور پھر گنتی کے لیے ہائی پاور لینس پر جائیں۔ اگر گننے سے پہلے یہ پایا جاتا ہے کہ بیکٹیریل محلول بہت گاڑھا یا بہت پتلا ہے، تو گنتی سے پہلے اسے دوبارہ ایڈجسٹ کرنا ضروری ہے۔ عام نمونہ کم کرنے کی ضرورت ہے۔
5-10 سیل موزوں ہیں۔ گنتی کے لیے ہر ایک چیمبر بیکٹیریا کو 5 درمیانی گرڈ (اختیاری 4 کونوں اور مرکزی گرڈز) میں منتخب کرتا ہے۔ گرڈ لائن پر موجود بیکٹیریا کو عام طور پر صرف اوپری اور دائیں لائنوں میں شمار کیا جاتا ہے۔ خمیر کے ابھرنے کی صورت میں، جب بڈ کے جسم کا سائز مدر سیل کے نصف تک پہنچ جائے تو دو بیکٹیریا گنیں۔ دو گنتی چیمبروں میں شمار کی گئی اقدار سے نمونے کے بیکٹیریل مواد کا حساب لگانے کے لیے ایک نمونہ شمار کریں۔
5. Hemocytometer کی صفائی
استعمال کے بعد، خون کے خلیوں کی گنتی کی پلیٹ کو نل پر پانی کے طیاروں سے دھوئیں، اسے سخت چیزوں سے نہ دھوئیں، اور دھونے کے بعد اسے خود سے یا ہیئر ڈرائر سے خشک کریں۔ خوردبینی معائنہ، مشاہدہ کریں کہ آیا ہر خلیے میں بقایا بیکٹیریا یا دیگر تلچھٹ موجود ہیں۔ اگر یہ صاف نہ ہو تو اسے صاف ہونے تک بار بار دھونا چاہیے۔
