فلوروسینس مائیکروسکوپی کا اصول اور اطلاق
(1) فلوروسینس مائیکروسکوپ کے اصول اور ساختی خصوصیات: فلوروسینس مائکروسکوپ فلٹر سسٹم کے ذریعے ایک خاص طول موج (جیسے الٹرا وایلیٹ لائٹ 3650 انچ یا پرپل بلیو لائٹ 4200 انچ) کی روشنی کو خارج کرنے کے لیے اعلیٰ برائٹ کارکردگی کے ساتھ ایک نقطہ روشنی کا ذریعہ استعمال کرتی ہے۔ نمونہ کو پرجوش کرنے کے لئے حوصلہ افزائی کی روشنی کے طور پر. فلوروسینٹ مادہ کے اندر مختلف رنگوں کی فلوروسینس خارج ہونے کے بعد، اسے معروضی لینس اور آئی پیس کی میگنیفیکیشن کے ذریعے دیکھا جاتا ہے۔ اس طرح، ایک مضبوط کنٹراسٹ پس منظر کے تحت، یہاں تک کہ اگر فلوروسینس بہت کمزور ہے، اس کی شناخت کرنا آسان ہے اور اس میں حساسیت زیادہ ہے۔ یہ بنیادی طور پر سیل کی ساخت اور فنکشن اور کیمیائی ساخت کی تحقیق کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ فلوروسینس مائیکروسکوپ کا بنیادی ڈھانچہ ایک عام آپٹیکل مائیکروسکوپ کے علاوہ کچھ لوازمات (جیسے فلوروسینٹ لائٹ سورس، ایک ایکسائٹیشن فلٹر، دو رنگوں کا بیم سپلٹر اور بلاک کرنے والا فلٹر وغیرہ) پر مشتمل ہوتا ہے۔ فلوروسینٹ روشنی کا ذریعہ - عام طور پر انتہائی ہائی پریشر مرکری لیمپ (50-200W) کا استعمال کریں، جو مختلف طول موجوں کی روشنی کو خارج کر سکتا ہے، لیکن ہر فلوروسینٹ مادہ میں ایک حوصلہ افزا طول موج ہوتی ہے جو مضبوط ترین فلوروسینس پیدا کرتی ہے، اس لیے اسے شامل کرنا ضروری ہے۔ اتیجیت فلٹر (عام طور پر، الٹرا وایلیٹ، جامنی، نیلے اور سبز اتیجیت فلٹر ہوتے ہیں)، جو صرف ایک مخصوص طول موج کی اتیجیت روشنی کو دوسرے روشنی کو جذب کرتے ہوئے نمونے سے گزرنے اور شعاع کرنے دیتے ہیں۔ ہر مادہ کو جوش کی روشنی سے شعاع کرنے کے بعد، یہ بہت ہی کم وقت میں شعاع ریزی کی طول موج سے زیادہ لمبی طول موج کے ساتھ مرئی فلوروسینس خارج کرتا ہے۔ فلوروسینس مخصوص اور عام طور پر جوش کی روشنی سے کمزور ہے۔ مخصوص فلوروسینس کا مشاہدہ کرنے کے لیے، معروضی لینس کے پیچھے ایک بلاکنگ (یا دبانے والا) فلٹر درکار ہوتا ہے۔ اس کے دو کام ہیں: ایک یہ ہے کہ جوش کی روشنی کو جذب کرنا اور اسے آئی پیس میں داخل ہونے سے روکنا، تاکہ فلوروسینس میں خلل نہ پڑے اور آنکھوں کو نقصان نہ پہنچے۔ دوسرا ہے منتخب کریں اور مخصوص فلوروسینس کو گزرنے دیں، ایک مخصوص فلوروسینٹ رنگ دکھا کر۔ دونوں فلٹرز کو ایک ساتھ استعمال کرنا چاہیے۔
ان کے نظری راستوں کے لحاظ سے فلوروسینس خوردبین کی دو قسمیں ہیں:
1. ٹرانسمیشن فلوروسینس مائیکروسکوپ: اتیجیت روشنی کا ماخذ کنڈینسر لینس کے ذریعے نمونے کے مواد کے ذریعے فلوروسینس کو اکساتا ہے۔ ایک تاریک فیلڈ کلیکٹر عام طور پر استعمال کیا جاتا ہے، اور ایک عام کلکٹر کو آئینے کو ایڈجسٹ کرنے کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے تاکہ جوش کی روشنی کو منتقل کیا جائے اور نمونے کو نظرانداز کیا جائے۔ یہ پرانے زمانے کا فلوروسینس مائکروسکوپ ہے۔ فائدہ یہ ہے کہ فلوروسینس کم میگنیفیکیشن پر مضبوط ہے، اور نقصان یہ ہے کہ میگنیفیکیشن بڑھنے کے ساتھ فلوروسینس کم ہو جاتی ہے۔ لہذا، یہ بڑے نمونہ مواد کا مشاہدہ کرنے کے لئے بہتر ہے.
2. Epi-fluorescence microscope یہ جدید دور میں تیار کردہ فلوروسینس مائکروسکوپ کی ایک نئی قسم ہے۔ فرق یہ ہے کہ جوش کی روشنی آبجیکٹیو لینس سے نمونے کی سطح پر گرتی ہے، یعنی وہی آبجیکٹیو لینس الیومینیشن کنڈینسر اور فلوروسینس کو جمع کرنے کے لیے مقصدی لینس کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔ روشنی کے راستے میں ایک dichroic beam splitter کو شامل کرنے کی ضرورت ہے، جو کہ ہلکے یورینیم سے 45 ڈگری دور ہے۔ جوش کی روشنی معروضی لینس میں منعکس ہوتی ہے اور نمونے پر جمع ہوتی ہے۔ نمونے سے پیدا ہونے والا فلوروسینس اور معروضی لینس کی لینس کی سطح اور کور شیشے کی سطح سے منعکس ہونے والی اتیجیت روشنی ایک ہی وقت میں معروضی لینس میں داخل ہوتی ہے، اور دو رنگوں کے بیم اسپلٹر پر واپس آتی ہے تاکہ جوش کی روشنی کو فلوروسینس سے الگ کیا جا سکے۔ , بقایا اتیجیت روشنی فلٹرز کو مسدود کرنے سے جذب ہو جاتی ہے۔ اگر آپ مختلف ایکسائٹیشن فلٹرز/دو رنگوں کے بیم سپلٹرز/بلاکنگ فلٹرز کے مجموعے میں تبدیل ہوتے ہیں تو مختلف فلوروسینٹ ری ایکشن مصنوعات کی ضروریات پوری کی جا سکتی ہیں۔ اس قسم کے فلوروسینس مائکروسکوپ کا فائدہ یہ ہے کہ فیلڈ آف ویو کی روشنی یکساں ہے، امیجنگ واضح ہے، اور جتنی زیادہ میگنیفیکیشن ہوگی، فلوروسینس اتنا ہی مضبوط ہوگا۔
(2) فلوروسینس مائکروسکوپ کا استعمال کیسے کریں۔
1. روشنی کا منبع آن کریں، انتہائی ہائی پریشر مرکری لیمپ کو روشن ترین مقام تک پہنچنے کے لیے چند منٹوں کے لیے گرم ہونے کی ضرورت ہے۔
2. ٹرانسمیشن فلوروسینس مائیکروسکوپ کے لیے، روشنی کے منبع اور کنڈینسر کے درمیان مطلوبہ ایکسائٹیشن فلٹر نصب کیا جانا چاہیے، اور متعلقہ بلاکنگ فلٹر کو مقصدی لینس کے پیچھے نصب کیا جانا چاہیے۔ Epi-fluorescence microscopes کو روشنی کے راستے میں سلاٹوں میں مطلوبہ ایکسائٹیشن فلٹر/ڈول کلر بیم اسپلٹر/بلاکنگ فلٹر داخل کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔
3. کم میگنیفیکیشن لینس کے ساتھ مشاہدہ کریں، اور روشنی کے منبع کے مرکز کو مختلف قسم کے فلوروسینس مائکروسکوپ کے ایڈجسٹمنٹ ڈیوائس کے مطابق ایڈجسٹ کریں تاکہ یہ پوری روشنی کی جگہ کے بیچ میں واقع ہو۔
4. نمونہ شیٹ رکھیں اور توجہ مرکوز کرنے کے بعد مشاہدہ کریں۔ استعمال کے دوران توجہ دی جانی چاہئے: اختتامی فلٹر کے ساتھ براہ راست مشاہدہ نہ کریں، تاکہ آنکھوں کو نقصان نہ پہنچے؛ آئل لینس کے ساتھ نمونے کا مشاہدہ کرتے وقت، فلوروسینس کے بغیر ایک خاص آئل لینس استعمال کرنا ضروری ہے؛ ہائی پریشر مرکری لیمپ کے بند ہونے کے بعد، اسے فوری طور پر دوبارہ آن نہیں کیا جا سکتا، اور اسے جانچنے کی ضرورت ہے۔ اسے 5 منٹ کے بعد دوبارہ شروع کیا جا سکتا ہے، ورنہ یہ غیر مستحکم ہو جائے گا اور مرکری لیمپ کی زندگی کو متاثر کرے گا۔
(3) مشاہدہ تدریسی پلیٹ فارم پر فلوروسینٹ مائیکروسکوپ کے نیچے نیلے بنفشی روشنی کے فلٹر کا استعمال کرتے ہوئے، یہ دیکھا جا سکتا ہے کہ o.01 فیصد ایکریڈائن اورنج فلوروسینٹ ڈائی سے داغے ہوئے خلیے، نیوکلئس اور سائٹوپلازم دو مختلف رنگوں کو پیدا کرنے کے لیے پرجوش ہیں۔ فلوروسینس (گہرا) سبز اور نارنجی سرخ)۔
