کئی خصوصی نظری خوردبین اور ان کے اختلافات
1 تاریک فیلڈ خوردبین
تاریک فیلڈ خوردبین میں آبجیکٹ کے اندر ٹھیک ساخت کا مشاہدہ کرنے کا کام نہیں ہے، لیکن یہ 0.004 μm سے اوپر کے ذرات کے وجود اور حرکت میں فرق کر سکتا ہے۔ لہذا، یہ اکثر زندہ خلیوں کی ساخت اور انٹرا سیلولر ذرات کی نقل و حرکت کا مشاہدہ کرنے کے لیے استعمال ہوتا ہے۔
تاریک فیلڈ مائکروسکوپی کا بنیادی اصول ٹنڈال اثر ہے۔ جب روشنی کا ایک شہتیر کسی تاریک کمرے سے گزرتا ہے، تو ہوا میں دھول کا ایک روشن "پاتھ وے" واقعہ کی روشنی کے لیے کھڑے سمت سے دیکھا جا سکتا ہے۔ یہ رجحان Tyndall اثر ہے.
ڈارک فیلڈ مائکروسکوپ کو ایک عام آپٹیکل مائیکروسکوپ پر ڈارک فیلڈ کنڈینسر سے تبدیل کرنے کے بعد، کنڈینسر کے اندرونی پیرابولک ڈھانچے کے بند ہونے کی وجہ سے، معائنہ کرنے والی چیز کی سطح پر شعاع کرنے والی روشنی براہ راست معروضی لینس میں داخل نہیں ہو سکتی اور آئی پیس، اور صرف بکھری ہوئی روشنی ہی گزر سکتی ہے، اس لیے دیکھنے کا میدان اندھیرا ہے۔
ڈارک فیلڈ مائکروسکوپی کا بنیادی استعمال درج ذیل ہے:
1. ایک ڈارک فیلڈ کنڈینسر انسٹال کریں (یا ہلکی شیلڈ بنانے کے لیے ایک موٹا سیاہ کاغذ استعمال کریں اور اسے ڈارک فیلڈ ایفیکٹس حاصل کرنے کے لیے ایک عام خوردبین کے کنڈینسر کے نیچے رکھیں)۔
2. ایک مضبوط روشنی کا ذریعہ منتخب کریں، عام طور پر ایک خوردبین روشنی کے ساتھ براہ راست روشنی کو معروضی لینس میں داخل ہونے سے روکنے کے لیے۔
3. کنڈینسر اور شیشے کی سلائیڈ کے درمیان دیودار کے تیل کا ایک قطرہ ڈالیں تاکہ کنڈینسر پر روشن ہونے والی روشنی کے مکمل انعکاس سے بچ سکیں، معائنہ کرنے کے لیے آبجیکٹ تک پہنچنے میں ناکامی اور تاریک فیلڈ الیومینیشن۔
4. سینٹر ایڈجسٹمنٹ انجام دیں، یعنی کنڈینسر کو افقی طور پر منتقل کریں تاکہ کنڈینسر کا آپٹیکل ایکسس اور مائکروسکوپ کا آپٹیکل ایکسس سختی سے سیدھی لائن پر ہو۔ کنڈینسر کو اٹھائیں اور نیچے کریں، کنڈینسر کے فوکل پوائنٹ (شکل 1-2 میں مخروطی بیم کا سب سے اوپر) کو جانچنے کے لیے آبجیکٹ سے سیدھ کریں۔
5. کنڈینسر کے مطابق معروضی لینس کا انتخاب کریں، فوکل کی لمبائی کو ایڈجسٹ کریں، اور عام خوردبین کے طریقہ کار کے مطابق کام کریں۔
سٹیریومائیکروسکوپ
سٹیریو مائیکروسکوپس، جسے ٹھوس خوردبین یا ڈسیکٹنگ آئینے کے نام سے بھی جانا جاتا ہے، ایک سیدھی تین جہتی خلائی تصویر بناتے ہیں، اور مضبوط سٹیریوسکوپک اثر، واضح اور وسیع امیجنگ، طویل کام کی دوری (عام طور پر 110 ملی میٹر) اور مسلسل میگنیفیکیشن دیکھنے کی خصوصیات رکھتے ہیں۔ اکثر حیاتیات میں ڈسکشن کے دوران حقیقی وقت کے مشاہدے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔
ایک عام آپٹیکل خوردبین کی روشنی کا ذریعہ متوازی روشنی ہے، لہذا یہ ایک دو جہتی جہاز کی تصویر بناتا ہے؛ جبکہ ایک سٹیریو مائیکروسکوپ ایک دوہری چینل آپٹیکل راستہ اپناتا ہے، اور بائنوکولر ٹیوب میں بائیں اور دائیں بیم کا ایک خاص زاویہ ہوتا ہے (عام طور پر 12o15o)، تو یہ تین جہتی خلا میں ایک سٹیریوسکوپک امیج بن سکتا ہے۔
سٹیریو خوردبینیں عام ہلکی خوردبینوں کی طرح استعمال ہوتی ہیں، لیکن زیادہ آسان ہیں۔ دونوں کے درمیان بنیادی فرق یہ ہے:
1. سٹیریو مائیکروسکوپس کے معائنہ کی اشیاء کو سلائیڈز بنانے کی ضرورت نہیں ہے۔
2. سٹیریو مائکروسکوپ کا مرحلہ براہ راست آئینے کی بنیاد پر طے ہوتا ہے، اور سیاہ اور سفید ڈبل رخا پینلز یا شیشے کے پینلز سے لیس ہوتا ہے، اور آپریٹر خوردبین معائنہ کی آبجیکٹ اور ضروریات کے مطابق انتخاب کر سکتا ہے۔
3. سٹیریو مائیکروسکوپ کی امیجنگ سیدھی ہے، جو ڈسیکشن آپریشنز کے لیے آسان ہے۔
4. سٹیریو مائیکروسکوپ میں صرف ایک معروضی لینس ہے، اور اس کی میگنیفکیشن کو ایڈجسٹ کرنے والے سکرو کو گھما کر مسلسل ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے۔
فلوروسینس خوردبین
فلوروسینس مائیکروسکوپی انٹرا سیلولر مادوں کے ذریعہ خارج ہونے والے فلوروسینس کی شدت پر گتاتمک اور مقداری تحقیق کے لئے ایک نظری ٹول ہے۔
خلیات میں دو قسم کے فلوروسینٹ مادے ہوتے ہیں، کوئی الٹرا وائلٹ شعاعوں جیسے کہ کلوروفل وغیرہ سے شعاع نکلنے کے بعد براہ راست فلوروسینٹ ہو سکتا ہے۔ دیگر مادوں میں یہ خاصیت نہیں ہوتی ہے، لیکن اگر مخصوص فلوروسینٹ رنگوں یا فلوروسینٹ اینٹی باڈیز سے داغ دیا جاتا ہے، تو وہ بالائے بنفشی شعاعوں کے ذریعے فلوروسینٹ ہو سکتے ہیں۔ شعاع ریزی کے بعد فلوریس بھی کر سکتے ہیں۔
سیدھا بایولومینیسینس مائیکروسکوپ/الٹی بایولومینیسینس مائکروسکوپ
فلوروسینس مائیکروسکوپ کا اصول یہ ہے کہ فلٹر سسٹم کے ذریعے ایک خاص طول موج (جیسے الٹرا وائلٹ لائٹ 3650λ یا پرپل بلیو لائٹ 4200λ) کی روشنی کو خارج کرنے کے لیے اعلی برائٹ کارکردگی (جیسے انتہائی ہائی پریشر مرکری لیمپ) کے ساتھ ایک پوائنٹ لائٹ سورس کا استعمال کیا جائے۔ نمونے میں فلوروسینٹ مادوں کو اکسانے کے لیے جوش کی روشنی کے طور پر۔ مختلف رنگوں کے فلوروسینس کے خارج ہونے کے بعد، اسے معروضی لینس کے پیچھے بلاکنگ (یا دبانے والے) فلٹر کے ذریعے فلٹر کیا جاتا ہے، اور پھر آئی پیس کی میگنیفیکیشن کے ذریعے مشاہدہ کیا جاتا ہے۔
بلاک کرنے والے فلٹر کے دو کام ہوتے ہیں: ایک یہ ہے کہ جوش کی روشنی کو جذب کرنا اور اسے آئی پیس میں داخل ہونے سے روکنا ہے تاکہ فلوروسینس میں خلل نہ پڑے اور آنکھوں کو نقصان نہ پہنچے۔ دوسرا یہ ہے کہ ایک مخصوص فلوروسینس کو منتخب کریں اور گزرنے دیں، ایک مخصوص فلوروسینٹ رنگ دکھا کر۔
آپٹیکل پاتھ کے اصول کے مطابق فلوروسینس خوردبین کو دو اقسام میں تقسیم کیا جا سکتا ہے:
1. ٹرانسمیشن فلوروسینس مائکروسکوپی
پرانے فلوروسینس خوردبینوں میں، فلوروسینس کو اکسانے کے لیے اتیجیت روشنی کا منبع نمونہ کے مواد سے ایک کنڈینسر کے ذریعے منتقل کیا جاتا ہے۔ فائدہ یہ ہے کہ فلوروسینس کم میگنیفیکیشن پر مضبوط ہے، لیکن نقصان یہ ہے کہ میگنیفیکیشن بڑھنے کے ساتھ فلوروسینس کم ہو جاتی ہے۔ لہذا یہ صرف بڑے نمونے کے مواد کو دیکھنے کے لئے موزوں ہے۔
2. ایپی فلوروسینس مائکروسکوپی
اتیجیت روشنی آبجیکٹیو لینس سے نمونے کی سطح پر گرتی ہے، یعنی وہی معروضی لینس الیومینیشن کنڈینسر اور فلوروسینس کو جمع کرنے کے لیے مقصدی لینس کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔
آپٹیکل پاتھ میں ایک ڈیکروک بیم اسپلٹر (ڈائیکروک آئینے) کو شامل کرنے کی ضرورت ہے، جو آپٹیکل محور کے ساتھ 45o کا زاویہ بناتا ہے۔ جوش کی روشنی معروضی لینس میں منعکس ہوتی ہے اور نمونے پر جمع ہوتی ہے۔ سلائیڈ کی سطح سے منعکس ہونے والی جوش کی روشنی ایک ہی وقت میں معروضی لینس میں داخل ہوتی ہے، دو رنگوں کے بیم اسپلٹر پر واپس آتی ہے، جوش کی روشنی کو فلوروسینس سے الگ کرتی ہے، اور باقی جوش کی روشنی کو بلاک کرنے والے فلٹر کے ذریعے جذب کیا جاتا ہے۔ اگر آپ مختلف ایکسائٹیشن فلٹرز/دو رنگوں کے بیم سپلٹرز/بلاکنگ فلٹرز کے مجموعے میں تبدیل ہوتے ہیں تو مختلف فلوروسینٹ ری ایکشن مصنوعات کی ضروریات پوری کی جا سکتی ہیں۔
اس قسم کے فلوروسینس مائکروسکوپ کا فائدہ یہ ہے کہ فیلڈ آف ویو کی روشنی یکساں ہے، امیجنگ واضح ہے، اور جتنی زیادہ میگنیفیکیشن ہوگی، فلوروسینس اتنا ہی مضبوط ہوگا۔
مرحلے کے برعکس خوردبین
ایک فیز کنٹراسٹ مائکروسکوپ ایک خوردبین ہے جو پیدا ہونے والے مرحلے کے فرق (یا نظری راستے کے فرق) کو اس وقت تبدیل کر سکتی ہے جب روشنی کسی چیز سے گزرتی ہے طول و عرض (روشنی کی شدت) میں تبدیلی۔ یہ بنیادی طور پر زندہ خلیوں، غیر داغدار بافتوں کے حصوں یا داغدار نمونوں کا مشاہدہ کرنے کے لیے استعمال ہوتا ہے جس میں تضاد نہیں ہے۔
انسانی آنکھ صرف نظر آنے والی روشنی کی طول موج (رنگ) اور طول و عرض میں ہونے والی تبدیلیوں کی شناخت کر سکتی ہے، لیکن مرحلے کی تبدیلیوں کی نہیں۔ تاہم، زیادہ تر حیاتیاتی نمونے انتہائی شفاف ہوتے ہیں، اور روشنی کی لہر کے طول و عرض میں سے گزرنے کے بعد بنیادی طور پر کوئی تبدیلی نہیں ہوتی، اور صرف مرحلے میں تبدیلی آتی ہے۔
فیز کنٹراسٹ خوردبین بنیادی طور پر نمونے سے گزرنے والی نظری روشنی کے نظری راستے کے فرق کو طول و عرض کے فرق میں تبدیل کرتی ہے، اس طرح مختلف ڈھانچوں کے درمیان تضاد کو بہتر بناتا ہے اور مختلف ڈھانچے کو واضح طور پر نظر آتا ہے۔ روشنی نمونے سے گزرنے کے بعد ریفریکٹ ہوتی ہے، اصل نظری راستے سے ہٹ جاتی ہے، اور ایک ہی وقت میں 1/4λ (طول موج) کی تاخیر ہوتی ہے۔ اگر اس میں 1/4λ اضافہ یا کمی کی جاتی ہے تو، آپٹیکل راستے کا فرق 1/2λ ہو جاتا ہے، اور دو بیم آپٹیکل ایکسس کے بعد مداخلت کرتے ہیں، طول و عرض کو مضبوط کریں، بڑھائیں یا کم کریں، اس کے برعکس کو بہتر بنائیں۔
ساختی طور پر، فیز کنٹراسٹ خوردبین اس میں عام نظری خوردبین سے مختلف ہیں:
1. کنڈلی ڈایافرام میں ایک ڈایافرام ہوتا ہے جس کی انگوٹھی کھلتی ہے، جو روشنی کے منبع اور کنڈینسر کے درمیان نصب ہوتی ہے۔ اس کا کام یہ ہے کہ کنڈینسر سے گزرنے والی روشنی کو کھوکھلی روشنی کا شنک بنانا اور نمونے پر توجہ مرکوز کرنا ہے۔
2. فیز پلیٹ فیز کنٹراسٹ مائکروسکوپ معروضی لینس کے اندر میگنیشیم فلورائیڈ کے ساتھ لیپت ایک فیز پلیٹ کا اضافہ کرتی ہے تاکہ براہ راست روشنی یا منتشر روشنی کے مرحلے میں 1/4λ تاخیر ہو سکے۔ فیز پلیٹ پر دو علاقے ہوتے ہیں، وہ حصہ جس سے براہ راست روشنی گزرتی ہے اسے "کنجوگیٹ سرفیس" کہا جاتا ہے، اور وہ حصہ جس سے منتشر روشنی گزرتی ہے اسے "معاوضہ سطح" کہا جاتا ہے۔ فیز پلیٹوں کو ان کے کام کرنے والے اثرات کے مطابق دو اقسام میں تقسیم کیا گیا ہے۔
(1) پلس فیز پلیٹ: براہ راست روشنی میں 1/4λ کی تاخیر ہوتی ہے، اور روشنی کی لہروں کے دو سیٹوں کے ملاپ کے بعد طول و عرض میں اضافہ ہوتا ہے، اور نمونہ کا ڈھانچہ ارد گرد کے درمیانے درجے سے زیادہ روشن ہوتا ہے، جس سے ایک روشن کنٹراسٹ (یا منفی کنٹراسٹ)۔
(2) بی پلس فیز پلیٹ: پھیلی ہوئی روشنی میں 1/4λ کی تاخیر ہوتی ہے، اور محور کے موافق ہونے کے بعد روشنی کے دو گروپوں کی روشنی کی لہریں گھٹ جاتی ہیں، اور طول و عرض چھوٹا ہو جاتا ہے۔ نمونہ کا ڈھانچہ ارد گرد کے درمیانے درجے سے زیادہ گہرا ہے، جو ایک گہرا کنٹراسٹ (یا مثبت کنٹراسٹ) بناتا ہے۔ فیز پلیٹ کے ساتھ معروضی لینس کو فیز کنٹراسٹ آبجیکٹیو لینس کہا جاتا ہے، جس پر اکثر معروضی لینس ہاؤسنگ پر "Ph" کا نشان ہوتا ہے۔
