فلوروسینس مائیکروسکوپی کے لیے نمونہ کی تیاری کے تقاضے
فلوروسینس مائیکروسکوپی کے لیے نمونے کی تیاری کے لیے تقاضے
(1) شیشے کی سلائیڈ
سلائیڈ گلاس کی موٹائی 0 کے درمیان ہونی چاہیے۔{1}}L2mm۔ ایک سلائیڈ جو بہت موٹی ہے ایک طرف زیادہ روشنی جذب کرے گی اور دوسری طرف نمونے پر جوش کی روشنی کو فوکس نہیں کر سکتی۔ سلائیڈز ہموار، موٹائی میں یکساں اور واضح آٹو فلوروسینس سے پاک ہونی چاہئیں۔ کبھی کبھی کوارٹج سلائیڈز استعمال کی جاتی ہیں۔
(2) شیشے کو ڈھانپیں۔
کور گلاس کی موٹائی تقریباً 0.17 ملی میٹر، ہموار ہے۔ حوصلہ افزائی کی روشنی کو مضبوط بنانے کے لیے، ایک انٹرفیس کور گلاس بھی استعمال کیا جا سکتا ہے، جو ایک خاص کور گلاس ہے جس میں مادوں کی کئی تہوں (جیسے میگنیشیم فلورائیڈ) کا لیپت ہوتا ہے جو مختلف طول موجوں کی روشنی پر مختلف مداخلتی اثرات مرتب کرتا ہے، جو کہ روشنی کو متاثر کر سکتا ہے۔ فلوروسینس ہموار. حوصلہ افزائی کی روشنی گزر جاتی ہے، اور حوصلہ افزائی کی روشنی منعکس ہوتی ہے، اور یہ منعکس حوصلہ افزائی کی روشنی نمونے کو پرجوش کر سکتی ہے۔
(3) نمونہ
ٹشو کے ٹکڑے یا دیگر نمونے زیادہ موٹے نہیں ہونے چاہئیں۔ اگر موٹائی بہت موٹی ہے تو، زیادہ تر جوش کی روشنی نمونے کے نچلے حصے میں استعمال کی جائے گی، جب کہ اوپری حصے کو براہ راست معروضی لینس کے ذریعے دیکھا جائے گا، مکمل طور پر پرجوش نہیں ہو سکتا۔ اس کے علاوہ، اوورلیپنگ سیلز یا نجاست کی وجہ سے فلوروسینس، پس منظر میں غیر مخصوص داغ داغ فیصلے کو متاثر کرتا ہے۔
(4) آئینے کا تیل
عام طور پر، ڈارک فیلڈ فلوروسینس مائیکروسکوپس اور آئل وسرجن مائکروسکوپ کے ساتھ نمونوں کا مشاہدہ کرتے وقت، وسرجن تیل کا استعمال کرنا ضروری ہے۔ خصوصی غیر فلوروسینٹ وسرجن تیل کا استعمال کرنا بہتر ہے۔ اس کے بجائے گلیسرین بھی استعمال کی جا سکتی ہے، اور مائع پیرافین بھی استعمال کیا جا سکتا ہے، لیکن ریفریکٹیو انڈیکس کم ہے، جس کا امیج کوالٹی پر معمولی اثر پڑتا ہے۔
فلوروسینس مائکروسکوپی کے لائٹ کیوب کو سمجھنا
فلوروسینس وہ روشنی ہے جو کسی مادے میں موجود الیکٹران ہلکی توانائی کو کم توانائی والی حالت سے زیادہ توانائی کی حالت میں جذب کرتے ہیں، اور پھر جب یہ کم توانائی والی حالت میں واپس آجاتی ہے تو روشنی چھوڑتی ہے۔ یہ غیر درجہ حرارت سے نکلنے والی روشنی ہے — luminescence۔ یعنی: مادہ مختصر لہر کی روشنی کو جذب کرتا ہے، پرجوش حالت میں داخل ہوتا ہے، اور لمبی لہر کی روشنی خارج کرتا ہے۔
چاہے یہ مادہ کا آٹو فلوروسینس ہو، فلوروسینٹ ڈائی ہو یا فلوروسینٹ پروٹین جس کا اظہار فیوژن سے ہوتا ہے، اسے روشنی کی ایک مخصوص طول موج (Excitation) سے پرجوش ہونے کی ضرورت ہے۔ الیکٹران کے ہجرت اور توانائی کھونے کے بعد، وہ ایک مخصوص لمبی طول موج (Emision) کی روشنی خارج کرتے ہیں۔ ، جو مخصوص فلوروسینس کی شناخت کے کام کو حاصل کرنے کے لئے پتہ لگانے کے نظام کے ذریعہ جمع کیا جاسکتا ہے۔
فلوروسینٹ لائٹ کیوب کیا ہے؟
فلوروسینس مائیکروسکوپ مشاہدے اور امیجنگ میں، مخصوص طول موج کی اتیجیت روشنی اور اس کے مطابق طویل طول موج کے اخراج کی روشنی فلوروسینس لائٹ کیوب کے ذریعے فراہم کی جاتی ہے، تاکہ فلوروسینس سگنل کو ننگی آنکھ، ڈسپلے اسکرین یا کیمرے کے ذریعے جمع کیا جا سکے۔ لہذا، فلوروسینس لائٹ کیوب اس بات کا تعین کرتا ہے کہ کیا پتہ لگایا جا سکتا ہے فلوروسینس سگنل کی کلیدی ڈیوائس، اس کی خصوصیات میں شامل ہیں EX: excitation wavelength filter parameters, EM: Emission wavelength filter parameters and DM: dichotomous mirror parameters. Revolve integrated fluorescence microscope کے DAPI لائٹ کیوب کو مثال کے طور پر لیں، EX: 385/30, EM: 450/50, DM: 425۔
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425nm روشنی EM میں منتقل کی جا سکتی ہے۔ EM اخراج کے فلٹرز کا استعمال فلوروفور کے ذریعے خارج ہونے والے فلوروسینس کو روشنی کو الگ کرنے کے لیے دیگر بیک گراؤنڈ آپٹیکل عناصر سے الگ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔ اخراج کے فلٹرز فلوروسینس طول موج پر ڈائیکروک آئینے کے ذریعے روشنی کو منتقل کرتے ہیں جبکہ دیگر تمام روشنیوں کو روکتے ہیں جو اتیجیت روشنی کے منبع (نمونہ یا آپٹکس سے جھلکتی ہے) سے نکلتی ہے۔ خارج ہونے والی روشنی کی طول موج مشاہدے کے لیے EM سے زیادہ ہے، یعنی صرف 450±25nm کی حد کے اندر روشنی ہی پتہ لگانے کے نظام میں داخل ہوتی ہے۔ EX، EM فلٹرز، اور DM dichotomies کا مناسب انتخاب محققین کو زیادہ سگنل ٹو شور ریشو (S/N) حاصل کرنے میں مدد کر سکتا ہے۔
