دو فوٹوون فلوروسینس مائکروسکوپ کی تکنیکی خصوصیات اور استعمال کی مہارتیں۔
ٹو فوٹون فلوروسینس مائیکروسکوپی ایک نئی ٹیکنالوجی ہے جو لیزر اسکیننگ کنفوکل مائیکروسکوپی اور ٹو فوٹوون ایکسائٹیشن ٹیکنالوجی کو یکجا کرتی ہے۔
دو فوٹوون کی حوصلہ افزائی کا بنیادی اصول یہ ہے: اعلی فوٹوون کثافت کی صورت میں، فلوروسینٹ مالیکیول ایک ہی وقت میں دو لمبی طول موج کے فوٹون کو جذب کر سکتے ہیں، اور نام نہاد پرجوش ریاست کی زندگی کے مختصر عرصے کے بعد ایک مختصر طول موج کے فوٹون کا اخراج کر سکتے ہیں۔ . ; اثر ویسی ہی ہے جیسے کسی فلوروسینٹ مالیکیول کو اکسانے کے لیے طول موج کے نصف لمبی طول موج کے ساتھ فوٹوون کا استعمال۔ دو فوٹوون اتیجیت کے لیے اعلی فوٹوون کثافت کی ضرورت ہوتی ہے۔ خلیات کو نقصان نہ پہنچانے کے لیے، دو فوٹون مائکروسکوپی ہائی انرجی موڈ لاکڈ پلسڈ لیزرز کا استعمال کرتی ہے۔ اس لیزر سے خارج ہونے والے لیزر میں اعلی چوٹی کی توانائی اور کم اوسط توانائی ہے، اس کی نبض کی چوڑائی صرف 100 فیمٹو سیکنڈ ہے، اور اس کی مدت 80 سے 100 میگا ہرٹز تک پہنچ سکتی ہے۔ جب پلسڈ لیزر کے فوٹون کو فوکس کرنے کے لیے ایک اعلی عددی یپرچر آبجیکٹیو لینس کا استعمال کرتے ہیں، تو آبجیکٹیو لینس کے فوکل پوائنٹ پر فوٹوون کی کثافت سب سے زیادہ ہوتی ہے، اور دو فوٹوون کا جوش صرف مقصدی لینس کے فوکل پوائنٹ پر ہوتا ہے۔ دو فوٹون مائکروسکوپ کو کنفوکل پن ہول کی ضرورت نہیں ہے، جو فلوروسینس کا پتہ لگانے کی کارکردگی کو بہتر بناتا ہے۔ یہ مورفولوجی، مالیکیولر سیل بائیولوجی، نیورو سائنس اور فارماکولوجی کے شعبوں میں ایک اہم تحقیقی طریقہ ہے۔
1. دو فوٹون مائکروسکوپی کے ظہور کا پس منظر - روایتی لیزر کنفوکل مائکروسکوپی کی دو حدود:
1) ایک فوٹوٹوکسیٹی رجحان ہے: کیونکہ کنفوکل پنہول ایک ہائی ریزولوشن امیج حاصل کرنے کے لیے اتنا چھوٹا ہونا چاہیے، اور چھوٹا یپرچر نمونے سے خارج ہونے والے فلوروسینس کے ایک بڑے حصے کو روک دے گا، بشمول فوکل ہوائی جہاز سے خارج ہونے والے فلوروسینس، متعلقہ ہاں، جوش کی روشنی اتنی مضبوط ہونی چاہیے کہ سگنل سے شور کا کافی تناسب حاصل کر سکے۔ اور زیادہ شدت والا لیزر مسلسل اسکیننگ کے دوران فلوروسینٹ ڈائی کو تیزی سے ختم کرنے کا سبب بنے گا، اور اسکیننگ کے آگے بڑھنے کے ساتھ ساتھ فلوروسینٹ سگنل کمزور اور کمزور ہوتا جائے گا۔
2) فوٹوٹوکسیٹی ایک اور مسئلہ ہے۔ لیزر شعاع ریزی کے تحت، بہت سے فلوروسینٹ ڈائی مالیکیول سائٹوٹوکسین جیسے سنگلٹ آکسیجن یا فری ریڈیکلز پیدا کریں گے، اس لیے نمونے کی کثافت کو برقرار رکھنے کے لیے تجربے میں اسکیننگ کا وقت اور ایکسائٹیشن لائٹ کی آپٹیکل پاور ڈینسٹی محدود ہونی چاہیے۔ فعال. فعال نمونوں پر تحقیق میں، خاص طور پر فعال نمونوں کی نشوونما اور نشوونما کے مختلف مراحل، فوٹو بلیچنگ اور فوٹو ٹوکسائٹی نے ان مطالعات کو بہت محدود کردیا ہے۔
2. آپ یہ کیوں کہتے ہیں کہ دو فوٹون خوردبینوں کو عام طور پر الٹرا وائلٹ ایکسائٹیشن لیزرز سے لیس کرنے کی ضرورت نہیں ہے؟
دو فوٹون مائکروسکوپی ایک فلوروسینس ایکسائٹیشن ٹیکنالوجی ہے جس کی بنیاد دو فوٹوون ایکسائٹیشن اثر پر ہوتی ہے: فلوروسینٹ ڈائی مالیکیول ایک ہی وقت میں دو کم توانائی والے فوٹونز کو جذب کرکے پرجوش ہوسکتے ہیں (فلوریسنٹ مالیکیولز تک پہنچنے والے دو فوٹون کے درمیان وقت کا وقفہ 1 فیمٹوز سیکنڈ سے کم ہوتا ہے۔ )، اس کا اتیجیت اثر 1/2 طول موج کے اعلی توانائی والے فوٹون کو جذب کرنے کے مترادف ہو سکتا ہے۔ مثال کے طور پر، سرخ طول موج پر دو فوٹون جذب کرنا الٹرا وائلٹ کو جذب کرنے والے مالیکیول کے برابر ہے۔ لمبی طول موج کے فوٹون خلیات کے ذریعے آسانی سے جذب نہیں ہوتے ہیں، اس لیے زندہ خلیوں میں فوٹو ٹوکسیٹی کم ہو جاتی ہے، اور فوٹو بلیچنگ بھی کم ہو جاتی ہے۔ اس طرح، یہ نہ صرف الٹرا وائلٹ اتیجیت کا کام کرتا ہے، بلکہ الٹرا وایلیٹ روشنی کے نمونے کو پہنچنے والے نقصان سے بھی بچاتا ہے۔
3. دو فوٹون مائکروسکوپ کے لیزر کے بارے میں کیا خاص بات ہے؟
دو فوٹوون کے جذب ہونے کا امکان اس بات پر منحصر ہے کہ دو واقعہ والے فوٹون جگہ اور وقت میں کتنے قریب سے ملتے ہیں (دو فوٹون کو 10-18 سیکنڈ کے اندر پہنچنا چاہیے)۔ دو فوٹوون جذب کرنے والا کراس سیکشن چھوٹا ہے، اور بڑے فوٹوون فلوکس والے خطوں میں صرف فلوروفورس ہی پرجوش ہیں۔ لہذا، استعمال ہونے والے زیادہ تر لیزرز ٹائٹینیم سیفائر لیزرز ہیں، جو picosecond یا femtosecond سکیننگ کی رفتار حاصل کر سکتے ہیں، اور ان میں بہت زیادہ چوٹی کی طاقت اور کم اوسط طاقت ہوتی ہے، تاکہ photobleaching اور phototoxicity کو کم یا ختم کیا جا سکے۔ سب سے اہم بات یہ ہے کہ ایک چھوٹی رینج میں فوٹون کی بہت زیادہ کثافت فراہم کی جائے، جو دو فوٹون کے بیک وقت جوش کو یقینی بنا سکے۔
4. دو فوٹوون جوش کے فوائد کیا ہیں؟
1) ڈائی کی سلیکٹیوٹی میں اضافہ کریں: کنفوکل سسٹم لیزر (Ar, Ar/Kr, HeNe) کی ایکسائٹیشن لائٹ رینج 488nm - 647nm ہے۔ اس کا مطلب ہے UV- پرجوش فلوروسینٹ رنگوں کے ساتھ تجربہ کرنا، جیسے DAPI , Hoescht کے ساتھ۔ دو فوٹوون کی اتیجیت طول موج سنگل فوٹون سے دوگنا ہے، لہذا الٹرا وایلیٹ سے پرجوش رنگ قریب اورکت روشنی سے پرجوش ہوسکتے ہیں۔
2) فوٹو بلیچنگ کو کم کریں: فوٹو بلیچنگ میں کمی کی وجہ سے، فلوروسینس ریزوننس انرجی ٹرانسفر (FRET) کے لیے CFP/YFP کا استعمال کرتے ہوئے تجربات کی کامیابی کی شرح بڑھ جاتی ہے۔
3) کسی خاص معروضی لینس کی ضرورت نہیں ہے: ہارڈ ویئر کے نقطہ نظر سے، قریب اورکت روشنی کی طول موج کے ساتھ UV- پرجوش رنگوں کے جوش کو خصوصی UV آپٹیکل اجزاء کی ضرورت نہیں ہوتی ہے۔
4) سگنل ٹو شور کے تناسب کو بہتر بنائیں: جوش کی روشنی کی طول موج اور خارج ہونے والی روشنی کی طول موج میں بڑا فرق ہے، جو سگنل ٹو شور کے تناسب کو بہتر بناتا ہے۔
5) بلیچنگ کو فوکل پوائنٹ پر لوکلائز کیا گیا: چونکہ فلوروسینس ایکسائٹیشن صرف مقصد کے فوکل پوائنٹ پر ہوتی ہے، اس لیے کنفوکل پن ہول کی ضرورت نہیں ہے۔ یہ روشنی کی کھوج کو بہتر بناتا ہے اور فوٹو بلیچنگ صرف فوکل پوائنٹ پر ہوتی ہے۔
6) نمونوں میں گھسنا آسان: انفراریڈ طول موج کی روشنی خلیات کے ذریعے آسانی سے بکھری نہیں جاتی اور گہرے نمونوں میں گھس سکتی ہے۔
5. لیزر اسکیننگ کنفوکل مائیکروسکوپی کے مقابلے میں، دو فوٹون مائیکروسکوپی کے ذریعے کی جانے والی سب سے بڑی بہتری کیا ہے؟
1) فوٹو بلیچنگ میں کمی۔
2) فوٹوٹوکسائٹی میں کمی۔
3) بکھرنا آسان نہیں ہے، اور موٹے نمونوں جیسے دماغ کے ٹکڑے کو گھسنا آسان ہے۔
