دو فوٹون فلوروسینس مائکروسکوپی کے بہت سے فوائد ہیں:
1) روشنی کی لمبی طول موج نمونے میں داخل ہونے کے لیے روشنی کی چھوٹی طول موج کے مقابلے میں بکھرنے سے کم متاثر ہوتی ہے۔
(2) فوکل ہوائی جہاز کے باہر فلوروسینٹ مالیکیولز پرجوش نہیں ہوتے ہیں تاکہ زیادہ جوش کی روشنی فوکل ہوائی جہاز تک پہنچ سکے، تاکہ جوش کی روشنی نمونے میں گہرائی میں داخل ہو سکے۔
3) قریب اورکت روشنی کی لمبی طول موج چھوٹی طول موج کی نسبت خلیات کے لیے کم زہریلی ہوتی ہے۔
4) نمونے کا مشاہدہ کرنے کے لیے دو فوٹون مائکروسکوپ کا استعمال کرتے وقت، فوٹو بلیچنگ اور فوٹو ٹوکسیٹی صرف فوکل پلین پر موجود ہوتی ہے۔ لہذا، دو فوٹوون خوردبینیں موٹے نمونوں کے مشاہدے کے لیے، زندہ خلیوں کے مشاہدے کے لیے، یا اسپاٹ فوٹو بلیچنگ کے تجربات کرنے کے لیے سنگل فوٹوون خوردبین سے زیادہ موزوں ہیں۔
کنفوکل فلوروسینس مائکروسکوپ کا علم
کنفوکل فلوروسینس مائکروسکوپ کا بنیادی اصول: ایک نقطہ روشنی کا ذریعہ نمونہ کو روشن کرنے کے لئے استعمال کیا جاتا ہے، فوکل ہوائی جہاز پر روشنی کا ایک چھوٹا، اچھی طرح سے متعین نقطہ بناتا ہے۔ شعاع ریزی کے بعد اس مقام سے خارج ہونے والے فلوروسینس کو معروضی عینک کے ذریعے جمع کیا جاتا ہے اور اصل شعاع ریزی کے راستے کے ساتھ دو جہتی رنگین عکس پر مشتمل بیم اسپلٹر کو واپس بھیج دیا جاتا ہے۔ بیم سپلٹر فلوروسینس کو براہ راست پکڑنے والے کو بھیجتا ہے۔ روشنی کا منبع اور ڈیٹیکٹر دونوں کے سامنے ایک پن ہول ہوتا ہے، جسے بالترتیب الیومینیشن پن ہول اور ڈیٹیکشن پن ہول کہتے ہیں۔ دونوں کی جیومیٹری ایک جیسی ہے، تقریباً 100-200 nm، اور فوکل ہوائی جہاز پر روشنی کے نقطہ کے حوالے سے جوڑ ہیں، یعنی، روشنی کا نقطہ عدسوں کی ایک سیریز سے گزرتا ہے اور بالآخر دونوں روشنیوں پر فوکس کیا جا سکتا ہے۔ اور پکڑنے والے پن ہولز۔ اس طرح، فوکل ہوائی جہاز سے روشنی تحقیقاتی یپرچر کے اندر جمع ہو سکتی ہے، جبکہ فوکل ہوائی جہاز کے اوپر یا نیچے سے بکھری ہوئی روشنی کو پروب اپرچر کے باہر بلاک کر دیا جاتا ہے اور اس کی تصویر نہیں بنائی جا سکتی۔ لیزر سیمپل پوائنٹ کو پوائنٹ کے حساب سے اسکین کرتا ہے، اور pinhole کا پتہ لگانے کے بعد فوٹوملٹیپلائر ٹیوب متعلقہ لائٹ پوائنٹ پوائنٹ کی کنفوکل امیج بھی بذریعہ پوائنٹ حاصل کرتی ہے، جسے ڈیجیٹل سگنل میں تبدیل کرکے کمپیوٹر میں منتقل کیا جاتا ہے، اور آخر میں ایک واضح شکل میں تبدیل ہوجاتا ہے۔ اسکرین پر پورے فوکل ہوائی جہاز کی confocal تصویر۔
ہر فوکل پلین امیج دراصل نمونے کا ایک آپٹیکل کراس سیکشن ہے، اور اس آپٹیکل کراس سیکشن کی ہمیشہ ایک خاص موٹائی ہوتی ہے، جسے آپٹیکل شیٹ بھی کہا جاتا ہے۔ چونکہ فوکل پوائنٹ پر روشنی کی شدت غیر فوکل پوائنٹ پر اس سے کہیں زیادہ ہوتی ہے، اور نان فوکل ہوائی جہاز کی روشنی کو پن ہول سے فلٹر کیا جاتا ہے، اس لیے کنفوکل سسٹم کے فیلڈ کی گہرائی صفر ہونے کا تخمینہ ہے، اور اسکیننگ Z-axis سمت کے ساتھ ساتھ آپٹیکل ٹوموگرافی کو فوکل اسپاٹ پر مشاہدہ کیے جانے والے نمونے کا ایک دو جہتی آپٹیکل ٹکڑا بنانے کے قابل بناتا ہے۔ XY طیارہ (فوکل طیارہ) اسکیننگ کو Z-axis (optical axis) اسکیننگ کے ساتھ ملا کر، نمونے کی ایک سہ جہتی تصویر دو جہتی تصاویر کی یکے بعد دیگرے پرتوں کو جمع کرکے حاصل کی جاسکتی ہے، جن پر خصوصی کمپیوٹر سافٹ ویئر کے ذریعے کارروائی کی جاتی ہے۔
اس کا مطلب ہے کہ پتہ لگانے والا پن ہول اور روشنی کا منبع پن ہول ہمیشہ ایک ہی نقطہ پر مرکوز ہوتے ہیں، تاکہ فوکل ہوائی جہاز کے باہر پرجوش فلوروسینس پتہ لگانے والے پن ہول میں داخل نہ ہو سکے۔
لیزر کنفوکل کے کام کرنے والے اصول کو سادہ طور پر بیان کیا گیا ہے کہ یہ روایتی فلوروسینس مائیکروسکوپ امیجنگ، اضافی لیزر سکیننگ ڈیوائس اور کنجوگیٹ فوکسنگ ڈیوائس کی بنیاد پر لیزر کو روشنی کے منبع کے طور پر استعمال کرتا ہے، کمپیوٹر کنٹرول کے ذریعے ڈیجیٹل امیج کے حصول اور پروسیسنگ سسٹم کو انجام دینے کے لیے۔
