فلوروسینس مائکروسکوپ اور نارمل مائکروسکوپ کے درمیان فرق
1. روشنی کا طریقہ دیکھیں
فلوروسینس مائیکروسکوپ کی روشنی کا طریقہ عام طور پر ایپی قسم کا ہوتا ہے، یعنی روشنی کا منبع معروضی لینس کے ذریعے ٹیسٹ کے نمونے پر رکھا جاتا ہے۔
2. قرارداد کو دیکھیں
فلوروسینس خوردبین الٹرا وایلیٹ روشنی کو روشنی کے منبع کے طور پر استعمال کرتی ہیں، نسبتاً کم طول موج کے ساتھ، لیکن ریزولوشن عام نظری خوردبینوں سے زیادہ ہے۔
3، فلٹر میں فرق
فلوروسینس مائیکروسکوپ دو خاص فلٹرز کا استعمال کرتی ہے، جو روشنی کے منبع کے سامنے نظر آنے والی روشنی کو فلٹر کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے، اور الٹرا وائلٹ روشنی کو فلٹر کرنے کے لیے معروضی لینس اور آئی پیس کے درمیان استعمال ہوتی ہے، جو انسانی آنکھوں کی حفاظت کر سکتی ہے۔
فلوروسینس مائکروسکوپ بھی آپٹیکل مائکروسکوپ کی ایک قسم ہے، بنیادی طور پر اس وجہ سے کہ فلوروسینس مائکروسکوپ کی طرف سے حوصلہ افزائی کی جانے والی طول موج کم ہوتی ہے، لہذا یہ فلوروسینس مائکروسکوپ اور عام خوردبین کی ساخت اور استعمال میں فرق کا باعث بنتی ہے۔ زیادہ تر فلوروسینس خوردبینوں میں کمزور روشنی کو پکڑنے کا اچھا کام ہوتا ہے۔ ، لہذا انتہائی کمزور فلوروسینس کے تحت، اس کی امیجنگ کی صلاحیت بھی اچھی ہے۔ حالیہ برسوں میں فلوروسینس مائکروسکوپی کی مسلسل بہتری کے ساتھ، شور بھی بہت کم ہو گیا ہے۔ لہذا، زیادہ سے زیادہ فلوروسینس خوردبین استعمال کیے جاتے ہیں.
دو فوٹون فلوروسینس مائکروسکوپی کا علم
دو فوٹوون کی حوصلہ افزائی کا بنیادی اصول یہ ہے: اعلی فوٹوون کی کثافت کی صورت میں، فلوروسینٹ مالیکیول ایک ہی وقت میں دو طویل طول موج کے فوٹون جذب کر سکتے ہیں، اور ایک بہت ہی مختصر نام نہاد پرجوش ریاست کی زندگی بھر کے بعد، ایک مختصر طول موج کا فوٹوون خارج کرتے ہیں۔ ; اثر ویسی ہی ہے جیسے کسی فلوروسینٹ مالیکیول کو اکسانے کے لیے طول موج کے نصف لمبی طول موج کے ساتھ فوٹون کا استعمال۔ دو فوٹوون کی حوصلہ افزائی کے لیے اعلیٰ فوٹوون کثافت کی ضرورت ہوتی ہے، اور خلیات کو نقصان نہ پہنچانے کے لیے، دو فوٹون مائکروسکوپی ہائی انرجی موڈ لاکڈ پلسڈ لیزر استعمال کرتی ہے۔ یہ لیزر اعلی چوٹی کی توانائی اور کم اوسط توانائی کے ساتھ لیزر روشنی خارج کرتا ہے، جس کی پلس چوڑائی صرف 100 فیمٹو سیکنڈز اور فریکوئنسی 80 سے 100 میگا ہرٹز ہے۔ جب ایک اعلی عددی یپرچر آبجیکٹیو لینس کا استعمال پلسڈ لیزر کے فوٹون کو فوکس کرنے کے لیے کیا جاتا ہے، تو آبجیکٹیو لینس کے فوکل پوائنٹ پر فوٹوون کی کثافت سب سے زیادہ ہوتی ہے، اور دو فوٹوون ایکسائٹیشن صرف مقصدی لینس کے فوکل پوائنٹ پر ہوتی ہے، لہذا دو فوٹوون مائکروسکوپ کو کنفوکل پن ہول کی ضرورت نہیں ہے، جو فلوروسینس کا پتہ لگانے کی کارکردگی کو بہتر بناتا ہے۔
عام فلوروسینس رجحان میں، جوش کی روشنی کی کم فوٹوون کثافت کی وجہ سے، ایک فلوروسینٹ مالیکیول ایک ہی وقت میں صرف ایک فوٹان کو جذب کر سکتا ہے، اور پھر تابکاری کی منتقلی کے ذریعے فلوروسینٹ فوٹوون خارج کر سکتا ہے، جسے سنگل فوٹون فلوروسینس کہا جاتا ہے۔ روشنی کے منبع کے طور پر لیزر کے ساتھ فلوروسینس اتیجیت کے عمل کے لئے، دو فوٹوون یا یہاں تک کہ ملٹی فوٹون فلوروسینس رجحان ہوسکتا ہے۔ اس وقت، استعمال ہونے والے اتیجیت روشنی کے ماخذ کی شدت زیادہ ہے، اور فوٹوون کی کثافت اس ضرورت کو پورا کرتی ہے کہ فلوروسینٹ مالیکیول ایک ہی وقت میں دو فوٹون جذب کرتا ہے۔ ایک عام لیزر کو اتیجیت روشنی کے ذریعہ کے طور پر استعمال کرنے کے عمل میں، فوٹوون کی کثافت اب بھی دو فوٹوون جذب پیدا کرنے کے لیے کافی نہیں ہے۔ عام طور پر، فیمٹوسیکنڈ پلسڈ لیزر استعمال کیا جاتا ہے، اور اس کی فوری طاقت میگاواٹ کے آرڈر تک پہنچ سکتی ہے۔ لہذا، دو فوٹون فلوروسینس کی طول موج اتیجیت روشنی کی طول موج سے کم ہے، جو نصف اتیجیت طول موج کے اتیجیت سے پیدا ہونے والے اثر کے برابر ہے۔
دو فوٹون فلوروسینس مائکروسکوپی کے بہت سے فوائد ہیں:
1) لمبی طول موج کی روشنی مختصر طول موج کی روشنی کے مقابلے میں بکھرنے سے کم متاثر ہوتی ہے اور نمونے میں آسانی سے داخل ہو سکتی ہے۔
2) فوکل ہوائی جہاز کے باہر فلوروسینٹ مالیکیولز پرجوش نہیں ہوتے ہیں، تاکہ زیادہ جوش کی روشنی فوکل ہوائی جہاز تک پہنچ سکے، تاکہ جوش کی روشنی گہرے نمونوں میں داخل ہو سکے۔
3) لمبی طول موج کے قریب اورکت روشنی مختصر طول موج کی روشنی سے خلیات کے لیے کم زہریلی ہے۔
4) دو فوٹون مائیکروسکوپی کے ساتھ نمونوں کو دیکھتے وقت، فوٹو بلیچنگ اور فوٹو ٹوکسیٹی صرف فوکل ہوائی جہاز میں موجود ہوتے ہیں۔ لہذا، دو فوٹون مائکروسکوپی سنگل فوٹون مائکروسکوپی کے مقابلے میں موٹے نمونوں کو دیکھنے کے لیے، زندہ خلیوں کو دیکھنے کے لیے، یا فکسڈ پوائنٹ فوٹو بلیچنگ کے تجربات کرنے کے لیے زیادہ موزوں ہے۔
کنفوکل فلوروسینس مائکروسکوپی کا علم
کنفوکل فلوروسینس مائیکروسکوپی کا بنیادی اصول: نمونہ کو روشن کرنے کے لیے ایک پوائنٹ لائٹ سورس کا استعمال کرتے ہوئے، فوکل ہوائی جہاز پر ایک اچھی طرح سے متعین خاکہ کے ساتھ روشنی کا ایک چھوٹا سا مقام بنتا ہے۔ بیم سپلٹر سے بنا۔ بیم سپلٹر فلوروسینس کو براہ راست پکڑنے والے کو بھیجتا ہے۔ روشنی کے منبع اور پتہ لگانے والے کے سامنے ایک پن ہول ہوتا ہے، جسے بالترتیب الیومینیشن پن ہول اور ڈیٹیکشن پن ہول کہتے ہیں۔ دونوں کے ہندسی طول و عرض ایک جیسے ہیں، تقریباً 100-200 nm; فوکل ہوائی جہاز پر روشنی کی جگہ کے مقابلے میں، دونوں ایک دوسرے سے جڑے ہوئے ہیں، یعنی، روشنی کی جگہ لینز کی ایک سیریز سے گزرتی ہے، اور آخر میں ایک ہی وقت میں الیومینیشن پن ہول اور ڈٹیکشن پن ہول پر فوکس کیا جا سکتا ہے۔ اس طرح، فوکل ہول سے روشنی کو پتہ لگانے والے سوراخ کی حد میں مرکوز کیا جا سکتا ہے، جبکہ فوکل ہول کے اوپر یا نیچے سے بکھری ہوئی روشنی کو پتہ لگانے والے سوراخ سے باہر روک دیا جاتا ہے اور اس کی تصویر نہیں بنائی جا سکتی۔ نمونے کو لیزر کے ذریعے پوائنٹ بہ پوائنٹ سکین کیا جاتا ہے، اور pinhole کا پتہ لگانے کے بعد فوٹوملٹیپلائر ٹیوب متعلقہ لائٹ پوائنٹ پوائنٹ کی کنفوکل امیج بھی بذریعہ پوائنٹ حاصل کرتی ہے، جسے ڈیجیٹل سگنل میں تبدیل کر کے کمپیوٹر پر منتقل کیا جاتا ہے، اور آخر میں جمع کیا جاتا ہے۔ پورے فوکل ہوائی جہاز کی ایک واضح کنفوکل امیج میں اسکرین۔ .
ہر فوکل پلین امیج دراصل نمونے کا ایک آپٹیکل کراس سیکشن ہے، اور اس آپٹیکل کراس سیکشن کی ہمیشہ ایک خاص موٹائی ہوتی ہے، جسے آپٹیکل سلائس بھی کہا جاتا ہے۔ چونکہ فوکل پوائنٹ پر روشنی کی شدت غیر فوکل پوائنٹ پر اس سے کہیں زیادہ ہوتی ہے، اور غیر فوکل ہوائی جہاز کی روشنی کو پن ہول سے فلٹر کیا جاتا ہے، اس لیے کنفوکل سسٹم کے فیلڈ کی گہرائی تقریباً صفر ہے، اور اسکیننگ Z-axis آپٹیکل ٹوموگرافی کو محسوس کر سکتا ہے، جس سے نمونے کے فوکسڈ جگہ پر دو جہتی آپٹیکل سیکشن کا مشاہدہ کیا جا سکتا ہے۔ XY طیارہ (فوکل طیارہ) اسکیننگ کو Z-axis (optical axis) اسکیننگ کے ساتھ ملا کر، یکے بعد دیگرے پرتوں کی دو جہتی تصاویر کو جمع کرکے اور خصوصی کمپیوٹر سافٹ ویئر کے ذریعے پروسیسنگ کرکے، نمونے کی تین جہتی تصویر حاصل کی جاسکتی ہے۔
یعنی پتہ لگانے والا پن ہول اور روشنی کا منبع پن ہول ہمیشہ ایک ہی نقطہ پر مرکوز ہوتے ہیں، تاکہ فوکس کرنے والے جہاز کے باہر پرجوش فلوروسینس پتہ لگانے والے پن ہول میں داخل نہ ہو سکے۔
کنفوکل لیزر کے کام کرنے والے اصول کا سادہ اظہار یہ ہے کہ یہ ایک لیزر کو روشنی کے منبع کے طور پر استعمال کرتا ہے، اور روایتی فلوروسینس مائیکروسکوپ امیجنگ کی بنیاد پر، ایک لیزر سکیننگ ڈیوائس اور کنجوگیٹ فوکس کرنے والا آلہ منسلک ہوتا ہے، اور ڈیجیٹل امیج کا حصول اور پروسیسنگ۔ سسٹم کو کمپیوٹر کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے۔
