کنفوکل لیزر مائیکروسکوپی کی خصوصیات اور اطلاقات
لیزر اسکیننگ کنفوکل مائیکروسکوپ (LSCM) ایک قسم کی مائیکروسکوپ ہے جسے کنجوگیٹ فوکس ٹیکنالوجی کی بنیاد پر ڈیزائن کیا گیا ہے، یعنی لیزر لائٹ کو ماخذ بنانے کے لیے، ٹیسٹ کے تحت نمونہ اور ڈٹیکٹر سب ایک دوسرے کی کنجوجیٹ پوزیشن میں ہیں۔
بنیادی
عام خوردبینوں میں، معروضی لینس کا فوکل طیارہ ڈیٹیکٹر کے ساتھ موافق ہوتا ہے تاکہ مشاہدہ شدہ تصویری طیارہ ملحقہ محوری طیارے سے الگ ہو جائے، جب کہ کنفوکل خوردبینوں میں، نمونہ کو ایک پھیلاؤ محدود روشنی کے مقام کا استعمال کرتے ہوئے روشن کیا جاتا ہے، اور یہ تنہائی کا اثر ریزولوشن کو بہتر بنانے کے لیے آوارہ روشنی کو فلٹر کرنے کے لیے اسپاٹ کنجوگیٹ کے فوکل پوائنٹ پر کلیکشن لائٹ پاتھ میں پن ہول کا استعمال کرکے حاصل کیا جاتا ہے۔
امیجنگ کی خصوصیات
صرف جمع شدہ نمونے کی تہہ سے منعکس ہونے والی روشنی ہی مجموعہ روشنی کے راستے کے چھوٹے سوراخ سے گزر سکتی ہے، اور بقیہ غیر متعلقہ نمونے کی تہہ کی عکاسی چھوٹے سوراخ سے مسدود ہوجاتی ہے۔ اس کے نتیجے میں قرارداد میں نمایاں اضافہ ہو سکتا ہے۔ ذیل میں دکھایا گیا ہے ایک ہی موٹے نمونے کی کثیر جہتی فلوروسینس مائکروسکوپی اور کنفوکل مائیکروسکوپی کا شانہ بہ شانہ موازنہ۔ جب تصویروں کا ایک سلسلہ مختلف فوکل طیاروں پر لیا جاتا ہے، تو جسے عام طور پر "z-stack" کہا جاتا ہے، پیدا کیا جا سکتا ہے، اور یہ تصویر کنفوکل مائیکروسکوپی کے ذریعہ پیش کردہ ریزولوشن اور کنٹراسٹ فوائد اور ان فوائد کی بنیادی وجوہات کو ظاہر کرتی ہے۔ ٹشو کے اوپر امیجنگ ہوائی جہاز کے ساتھ اسٹیک کے اوپری حصے کی تصویر کی جانچ کرنے سے فلوروسینس امیج میں بہت سی بکھری ہوئی روشنی ظاہر ہوتی ہے، جب کہ کنفوکل امیج سیاہ دکھائی دیتی ہے۔ محوری سمت میں PSF میں یہ کمی Z-stack کے وسط میں آپٹیکل انٹرفیس پر مشاہدہ کردہ ریزولوشن میں فرق کے لیے براہ راست ذمہ دار ہے۔
لیزر اسکیننگ کنفوکل مائکروسکوپی کی ایک اور خصوصیت یہ ہے کہ یہ اسکیننگ امیجنگ ٹیکنالوجی ہے۔ روایتی وسیع فیلڈ الیومینیشن ٹکنالوجی پورے نمونے کو روشن کرتی ہے، لہذا تصویر کو ننگی آنکھ یا ایک ڈیٹیکٹر کے ذریعے براہ راست پکڑا جا سکتا ہے، لیکن ایل ایس سی ایم ایک بیم کا استعمال کرتا ہے یا ایک سے زیادہ فوکسڈ بیم سکیننگ اور امیجنگ کے لیے نمونے سے گزرتی ہے، اور اس کے نتیجے میں تصویر آپٹیکل سیکشن کہلاتا ہے۔ مندرجہ ذیل روایتی وسیع فیلڈ الیومینیشن طریقہ اور لیزر اسکیننگ کنفوکل الیومینیشن طریقہ کے درمیان فرق کو ظاہر کرتا ہے۔
لہذا، ایک جدید کنفوکل مائکروسکوپ کا عملی کام کرنے کا طریقہ نیچے دی گئی تصویر میں دکھایا گیا ہے۔ لیزر کی طرف سے خارج ہونے والی حوصلہ افزائی کی روشنی ایک dichroic آئینے سے گزرتی ہے اور نمونے کی x اور y سمتوں میں ہلنے والے آئینے کے ذریعے اسکین کرتی ہے۔ نمونے کا جوش (یا انعکاس) روشنی پن ہول کے ذریعے PMT ڈیٹیکٹر میں داخل ہوتی ہے اور اسے ریکارڈ کیا جاتا ہے، اور ریکارڈ شدہ سکیننگ امیج کو کمپیوٹر کے ذریعے دوبارہ بنایا جاتا ہے تاکہ اصل نمونہ کی تصویر حاصل کی جا سکے۔
