فلوروسینس خوردبین اصول کی درخواست اور استعمال
(1) فلوروسینس مائیکروسکوپ کے اصول اور ساختی خصوصیات: فلوروسینس مائکروسکوپ فلٹر سسٹم کے ذریعے ایک خاص طول موج (جیسے الٹرا وایلیٹ لائٹ 3650 انچ یا پرپل بلیو لائٹ 4200 انچ) کی روشنی کو خارج کرنے کے لیے اعلیٰ برائٹ کارکردگی کے ساتھ ایک نقطہ روشنی کا ذریعہ استعمال کرتی ہے۔ نمونہ کو پرجوش کرنے کے لئے حوصلہ افزائی کی روشنی کے طور پر. فلوروسینٹ مادہ کے اندر مختلف رنگوں کی فلوروسینس خارج ہونے کے بعد، اسے معروضی لینس اور آئی پیس کی میگنیفیکیشن کے ذریعے دیکھا جاتا ہے۔ اس طرح، ایک مضبوط کنٹراسٹ پس منظر کے تحت، یہاں تک کہ اگر فلوروسینس بہت کمزور ہے، اس کی شناخت کرنا آسان ہے اور اس کی حساسیت زیادہ ہے۔ یہ بنیادی طور پر سیل کی ساخت اور فنکشن اور کیمیائی ساخت کی تحقیق کے لیے استعمال ہوتا ہے۔ فلوروسینس مائیکروسکوپ کا بنیادی ڈھانچہ ایک عام آپٹیکل مائیکروسکوپ کے علاوہ کچھ لوازمات (جیسے فلوروسینٹ لائٹ سورس، ایک ایکسیٹیشن فلٹر، دو رنگوں کا بیم سپلٹر اور بلاک کرنے والا فلٹر وغیرہ) پر مشتمل ہوتا ہے۔ فلوروسینٹ روشنی کا ذریعہ - عام طور پر انتہائی ہائی پریشر مرکری لیمپ (50-200W) کا استعمال کریں، جو مختلف طول موجوں کی روشنی کو خارج کر سکتا ہے، لیکن ہر فلوروسینٹ مادہ میں ایک اتیجیت طول موج ہوتی ہے جو سب سے مضبوط فلوروسینس پیدا کرتی ہے، اس لیے ایک ایکسائٹیشن فلٹر (عام طور پر، بالائے بنفشی، جامنی، نیلے اور سبز اتیجیت کے فلٹر ہیں)، جو صرف ایک مخصوص طول موج کی اتیجیت روشنی کو گزرنے دیتے ہیں اور نمونے کو شعاع بناتے ہیں، جبکہ دوسری روشنی کو جذب کرتے ہیں۔ ہر ایک مادہ کو جوش کی روشنی سے شعاع کرنے کے بعد، یہ بہت کم وقت میں شعاع ریزی کی طول موج سے زیادہ لمبی طول موج کے ساتھ مرئی فلوروسینس خارج کرتا ہے۔ فلوروسینس مخصوص اور عام طور پر جوش کی روشنی سے کمزور ہے۔ مخصوص فلوروسینس کا مشاہدہ کرنے کے لیے، معروضی لینس کے پیچھے ایک بلاکنگ (یا دبانے والا) فلٹر درکار ہوتا ہے۔ اس کے دو کام ہیں: ایک یہ ہے کہ جوش کی روشنی کو جذب کرنا اور اسے آئی پیس میں داخل ہونے سے روکنا، تاکہ فلوروسینس میں خلل نہ پڑے اور آنکھوں کو نقصان نہ پہنچے۔ دوسرا ہے منتخب کریں اور مخصوص فلوروسینس کو گزرنے دیں، ایک مخصوص فلوروسینٹ رنگ دکھا کر۔ دونوں فلٹرز کو ایک ساتھ استعمال کرنا چاہیے۔
ان کے نظری راستوں کے لحاظ سے فلوروسینس خوردبین کی دو قسمیں ہیں:
1. ٹرانسمیشن فلوروسینس مائیکروسکوپ: فلوروسینس کو اکسانے کے لیے اتیجیت روشنی کا ذریعہ نمونہ کے مواد سے ایک کنڈینسر لینس کے ذریعے منتقل کیا جاتا ہے۔ ایک تاریک فیلڈ کلیکٹر عام طور پر استعمال کیا جاتا ہے، اور ایک عام کلکٹر کو آئینے کو ایڈجسٹ کرنے کے لیے بھی استعمال کیا جا سکتا ہے تاکہ جوش کی روشنی کو ری ڈائریکٹ کیا جائے اور نمونے کو نظرانداز کیا جائے۔ یہ ایک پرانا فلوروسینٹ خوردبین ہے۔ فائدہ یہ ہے کہ فلوروسینس کم میگنیفیکیشن پر مضبوط ہے، لیکن نقصان یہ ہے کہ میگنیفیکیشن بڑھنے کے ساتھ فلوروسینس کم ہو جاتی ہے۔ لہذا، بڑے نمونہ مواد کا مشاہدہ کرنا بہتر ہے.
2. Epi-fluorescence microscope جدید دور میں تیار کی گئی فلوروسینس مائکروسکوپ کی ایک نئی قسم ہے۔ فرق یہ ہے کہ جوش کی روشنی آبجیکٹیو لینس سے نمونے کی سطح پر گرتی ہے، یعنی وہی آبجیکٹیو لینس الیومینیشن کنڈینسر اور فلوروسینس کو جمع کرنے کے لیے مقصدی لینس کے طور پر استعمال ہوتا ہے۔ روشنی کے راستے میں ایک dichroic beam splitter کو شامل کرنے کی ضرورت ہے، جو کہ ہلکے یورینیم سے 45 ڈگری دور ہے۔ جوش کی روشنی معروضی لینس میں منعکس ہوتی ہے اور نمونے پر جمع ہوتی ہے۔ نمونے سے پیدا ہونے والا فلوروسینس اور معروضی لینس کی لینس کی سطح اور کور شیشے کی سطح سے منعکس ہونے والی اتیجیت روشنی ایک ہی وقت میں معروضی لینس میں داخل ہوتی ہے، اور دو رنگوں کے بیم اسپلٹر پر واپس آتی ہے تاکہ جوش کی روشنی کو فلوروسینس سے الگ کیا جا سکے۔ , بقایا اتیجیت روشنی فلٹرز کو مسدود کرنے سے جذب ہو جاتی ہے۔ جیسے کہ مختلف ایکسائٹیشن فلٹر/دو رنگوں کے بیم اسپلٹر/بلاکنگ فلٹر کے امتزاج میں تبدیل ہونا، یہ مختلف فلوروسینٹ ری ایکشن مصنوعات کی ضروریات کو پورا کر سکتا ہے۔ اس قسم کے فلوروسینس مائکروسکوپ کا فائدہ یہ ہے کہ فیلڈ آف ویو کی روشنی یکساں ہے، امیجنگ واضح ہے، اور جتنی زیادہ میگنیفیکیشن ہوگی، فلوروسینس اتنا ہی مضبوط ہوگا۔
(2) فلوروسینس مائکروسکوپ کا استعمال کیسے کریں۔
1. روشنی کا منبع آن کریں، اور انتہائی ہائی پریشر مرکری لیمپ کو روشن ترین مقام تک پہنچنے کے لیے چند منٹوں کے لیے گرم ہونے کی ضرورت ہے۔
2. ٹرانسمیشن فلوروسینس مائیکروسکوپ کو روشنی کے منبع اور کنڈینسر کے درمیان مطلوبہ اتیجیت فلٹر انسٹال کرنے اور معروضی لینس کے پیچھے متعلقہ بلاکنگ فلٹر کو انسٹال کرنے کی ضرورت ہے۔ Epi-fluorescence microscopes کو روشنی کے راستے میں سلاٹوں میں مطلوبہ ایکسائٹیشن فلٹر/ڈبل کلر بیم اسپلٹر/بلاکنگ فلٹر داخل کرنے کی ضرورت ہوتی ہے۔
3. کم میگنیفیکیشن لینس کے ساتھ مشاہدہ کریں، اور روشنی کے منبع کے مرکز کو ایڈجسٹ کریں تاکہ یہ فلوروسینس مائکروسکوپ کے مختلف ماڈلز کے ایڈجسٹمنٹ ڈیوائس کے مطابق پوری روشنی کی جگہ کے مرکز میں واقع ہو۔
4. نمونہ کا ٹکڑا رکھیں اور توجہ مرکوز کرنے کے بعد مشاہدہ کریں۔ استعمال کے دوران توجہ دی جانی چاہئے: اختتامی فلٹر کے ساتھ براہ راست مشاہدہ نہ کریں، تاکہ آنکھ کو نقصان نہ پہنچے۔ آئل لینس کے ساتھ نمونوں کا مشاہدہ کرتے وقت، فلوروسینس کے بغیر ایک خاص آئل لینس استعمال کرنا ضروری ہے؛ ہائی پریشر مرکری لیمپ کے بند ہونے کے بعد، اسے فوری طور پر دوبارہ آن نہیں کیا جا سکتا، اسے جانچنے کی ضرورت ہے۔ اسے 5 منٹ کے بعد دوبارہ شروع کیا جا سکتا ہے، ورنہ یہ غیر مستحکم ہو جائے گا اور مرکری لیمپ کی زندگی کو متاثر کرے گا۔
(3) ٹیچنگ پلیٹ فارم پر فلوروسینٹ مائیکروسکوپ کے نیچے 0.01 فیصد ایکریڈائن اورنج فلوروسینٹ ڈائی سے داغے ہوئے خلیوں کا مشاہدہ کریں جس میں نیلے بنفشی لائٹ فلٹر ہے۔ نیوکلئس اور سائٹوپلازم فلوروسینس کے دو مختلف رنگوں (گہرا سبز اور نارنجی سرخ) پیدا کرنے کے لیے پرجوش ہیں۔
