فلوروسینس مائکروسکوپی روایتی مائکروسکوپی سے مختلف ہے۔
فلوروسینس خوردبین الٹرا وائلٹ روشنی کو روشنی کے منبع کے طور پر استعمال کرتی ہیں تاکہ معائنہ کی جانے والی شے کو روشن کیا جاسکے، تاکہ شے روشنی خارج کرے، اور پھر خوردبین کے نیچے آبجیکٹ کا مشاہدہ کریں۔ یہ بنیادی طور پر امیونو فلوروسینس خلیوں کے لئے استعمال ہوتا ہے۔ یہ بنیادی طور پر روشنی کے منبع، ایک فلٹر پلیٹ سسٹم اور ایک نظری نظام پر مشتمل ہوتا ہے جو آئی پیس اور معروضی لینس کی میگنیفیکیشن کے ذریعے نمونے کی فلوروسینٹ امیج کا مشاہدہ کرتا ہے۔ آئیے اس فلوروسینس مائکروسکوپ اور ایک عام آپٹیکل مائکروسکوپ کے درمیان فرق پر ایک نظر ڈالتے ہیں۔
1. روشنی کا طریقہ دیکھیں
فلوروسینس مائکروسکوپ کی روشنی کا طریقہ عام طور پر ایپسکوپک ہوتا ہے، یعنی کہ روشنی کا منبع معروضی عینک کے ذریعے ٹیسٹ کے نمونے پر پیش کیا جاتا ہے۔
2. قرارداد کو دیکھیں
فلوروسینس خوردبین الٹراوائلٹ روشنی کو روشنی کے منبع کے طور پر استعمال کرتی ہے، اور طول موج نسبتاً کم ہے، لیکن ریزولوشن عام نظری خوردبینوں سے زیادہ ہے۔
3. فلٹر میں فرق
فلوروسینس خوردبین دو خاص فلٹرز استعمال کرتی ہیں، جو روشنی کے منبع کے سامنے نظر آنے والی روشنی کو فلٹر کرنے کے لیے استعمال ہوتے ہیں، اور الٹرا وائلٹ شعاعوں کو فلٹر کرنے کے لیے معروضی لینس اور آئی پیس کے درمیان استعمال ہوتے ہیں، جو انسانی آنکھوں کی حفاظت کر سکتے ہیں۔
فلوروسینس مائیکروسکوپ بھی ایک قسم کی آپٹیکل مائکروسکوپ ہے، بنیادی طور پر اس وجہ سے کہ فلوروسینس مائکروسکوپ کے ذریعے پرجوش طول موج کم ہوتی ہے، اس لیے یہ فلوروسینس مائکروسکوپ اور عام خوردبین کے درمیان ساخت اور استعمال میں فرق کا باعث بنتی ہے۔ زیادہ تر فلوروسینس خوردبین کمزور روشنی کو پکڑنے کا ایک اچھا کام کرتی ہیں، لہذا انتہائی کمزور فلوروسینس کے تحت، اس کی امیجنگ کی صلاحیت بھی اچھی ہوتی ہے۔ حالیہ برسوں میں فلوروسینس مائکروسکوپ کی مسلسل بہتری کے ساتھ، شور بھی بہت کم ہو گیا ہے۔ لہذا زیادہ سے زیادہ فلوروسینس مائکروسکوپ استعمال کیے جاتے ہیں۔
جوڑی
فوٹون فلوروسینس مائیکروسکوپی کے بارے میں علم
دو فوٹوون کی حوصلہ افزائی کا بنیادی اصول یہ ہے: اعلی فوٹوون کثافت کی صورت میں، فلوروسینٹ مالیکیول ایک ہی وقت میں دو لمبی طول موج کے فوٹون کو جذب کر سکتے ہیں، اور ایک مختصر نام نہاد پرجوش ریاست کی زندگی کے بعد ایک مختصر طول موج کے فوٹون کا اخراج کر سکتے ہیں۔ اثر فلوروسینٹ مالیکیولز کو اکسانے کے لیے لمبی طول موج کے نصف طول موج کے ساتھ فوٹون کا استعمال کرنے جیسا ہے۔ دو فوٹوون اتیجیت کے لیے اعلی فوٹوون کثافت کی ضرورت ہوتی ہے۔ خلیات کو نقصان نہ پہنچانے کے لیے، دو فوٹون مائکروسکوپی ہائی انرجی موڈ لاکڈ پلسڈ لیزرز کا استعمال کرتی ہے۔ اس لیزر سے خارج ہونے والے لیزر میں اعلی چوٹی کی توانائی اور کم اوسط توانائی ہے، اس کی نبض کی چوڑائی صرف 100 فیمٹو سیکنڈ ہے، اور اس کی فریکوئنسی 80 سے 100 میگا ہرٹز تک پہنچ سکتی ہے۔ جب پلسڈ لیزر کے فوٹون کو فوکس کرنے کے لیے ایک اعلی عددی یپرچر آبجیکٹیو لینس کا استعمال کرتے ہیں، تو آبجیکٹیو لینس کے فوکل پوائنٹ پر فوٹوون کی کثافت سب سے زیادہ ہوتی ہے، اور دو فوٹوون کا جوش صرف مقصدی لینس کے فوکل پوائنٹ پر ہوتا ہے۔ دو فوٹون مائکروسکوپ کو کنفوکل پن ہول کی ضرورت نہیں ہے، جو فلوروسینس کا پتہ لگانے کی کارکردگی کو بہتر بناتا ہے۔
عام فلوروسینس مظاہر میں، جوش کی روشنی کی کم فوٹوون کثافت کی وجہ سے، ایک فلوروسینٹ مالیکیول ایک ہی وقت میں صرف ایک فوٹوون کو جذب کر سکتا ہے، اور پھر ایک ریڈی ایٹیو ٹرانزیشن کے ذریعے فلوروسینٹ فوٹون خارج کر سکتا ہے، جو کہ سنگل فوٹون فلوروسینس ہے۔ روشنی کے منبع کے طور پر لیزر کا استعمال کرتے ہوئے فلوروسینس حوصلہ افزائی کے عمل کے لئے، دو فوٹوون یا یہاں تک کہ ملٹی فوٹون فلوروسینس ہوسکتا ہے۔ اس وقت، استعمال ہونے والے اتیجیت روشنی کے ماخذ کی شدت زیادہ ہے، اور فوٹوون کی کثافت فلوروسینٹ مالیکیولز کی ضروریات کو پورا کرتی ہے جو بیک وقت دو فوٹون جذب کرتے ہیں۔ ایک عام لیزر کو اتیجیت روشنی کے ذریعہ کے طور پر استعمال کرنے کے عمل میں، فوٹوون کی کثافت اب بھی دو فوٹوون جذب کرنے کے رجحان کو پیدا کرنے کے لیے کافی نہیں ہے۔ عام طور پر، فیمٹوسیکنڈ پلسڈ لیزر استعمال کیا جاتا ہے، اور اس کی فوری طاقت میگاواٹ کے آرڈر تک پہنچ سکتی ہے۔ لہذا، دو فوٹون فلوروسینس کی طول موج اتیجیت روشنی کی طول موج سے کم ہے، جو کہ نصف اتیجیت طول موج پر جوش سے پیدا ہونے والے اثر کے برابر ہے۔
دو فوٹون فلوروسینس مائکروسکوپی کے بہت سے فوائد ہیں:
1) لمبی طول موج کی روشنی مختصر طول موج کی روشنی کے مقابلے میں بکھرنے سے کم متاثر ہوتی ہے اور آسانی سے نمونے میں داخل ہو جاتی ہے۔
2) فوکل ہوائی جہاز کے باہر فلوروسینٹ مالیکیولز پرجوش نہیں ہوتے ہیں، تاکہ زیادہ جوش کی روشنی فوکل ہوائی جہاز تک پہنچ سکے، تاکہ جوش کی روشنی گہرے نمونوں میں داخل ہو سکے۔
3) لمبی طول موج کے قریب اورکت روشنی مختصر طول موج کی روشنی کے مقابلے میں خلیات کے لیے کم زہریلی ہے۔
4) نمونوں کا مشاہدہ کرنے کے لیے دو فوٹوون مائکروسکوپ کا استعمال کرتے وقت، فوٹو بلیچنگ اور فوٹو ٹوکسٹی صرف فوکل پلین میں ہوتی ہے۔ لہذا، دو فوٹون مائکروسکوپی موٹے نمونوں کے مشاہدے کے لیے، زندہ خلیوں کے مشاہدے کے لیے، یا اسپاٹ فوٹو بلیچنگ کے تجربات کے لیے سنگل فوٹون مائکروسکوپی سے زیادہ موزوں ہے۔
کنفوکل فلوروسینس مائکروسکوپی کے بارے میں علم
کنفوکل فلوروسینس مائیکروسکوپی کا بنیادی اصول: نمونے کو ایک نقطہ روشنی کے ذریعہ سے شعاع کیا جاتا ہے، اور فوکل ہوائی جہاز پر ایک چھوٹا، اچھی طرح سے واضح روشنی کی جگہ بنتی ہے۔ نقطہ کے شعاع ہونے کے بعد، خارج ہونے والے فلوروسینس کو معروضی لینس کے ذریعے جمع کیا جاتا ہے اور اصل روشنی کے راستے کے ساتھ ایک ڈائکروک آئینے پر مشتمل بیم اسپلٹر کو واپس بھیج دیا جاتا ہے۔ بیم سپلٹر فلوروسینس کو براہ راست پکڑنے والے کو بھیجتا ہے۔ روشنی کے منبع اور پتہ لگانے والے کے سامنے ایک پن ہول ہے، جسے بالترتیب الیومینیشن پن ہول اور ڈیٹیکشن پن ہول کہتے ہیں۔ دونوں کا ہندسی سائز ایک جیسا ہے، تقریباً 100-200nm; فوکل ہوائی جہاز پر روشنی کی جگہ کے مقابلے میں، دونوں ایک دوسرے سے جڑے ہوئے ہیں، یعنی، روشنی کی جگہ لینز کی ایک سیریز سے گزرتی ہے، اور آخر میں ایک ہی وقت میں الیومینیشن پن ہول اور ڈٹیکشن پن ہول پر فوکس کیا جا سکتا ہے۔ اس طرح، فوکل طیارے سے روشنی کو پتہ لگانے کے سوراخ کے دائرہ کار میں تبدیل کیا جاسکتا ہے، جبکہ فوکل طیارے کے اوپر یا نیچے سے بکھری ہوئی روشنی کو پتہ لگانے والے سوراخ کے باہر روک دیا جاتا ہے اور اس کی تصویر نہیں بنائی جا سکتی۔ لیزر سیمپل پوائنٹ کو پوائنٹ کے حساب سے اسکین کرتا ہے، اور pinhole کا پتہ لگانے کے بعد فوٹوملٹیپلائر ٹیوب متعلقہ لائٹ پوائنٹ پوائنٹ کی کنفوکل امیج بھی بذریعہ پوائنٹ حاصل کرتی ہے، جسے ڈیجیٹل سگنل میں تبدیل کرکے کمپیوٹر پر منتقل کیا جاتا ہے، اور آخر میں ایک واضح شکل میں جمع کیا جاتا ہے۔ اسکرین پر پورے فوکل ہوائی جہاز کی confocal تصویر۔
ہر فوکل پلین امیج دراصل نمونے کا آپٹیکل کراس سیکشن ہے، اور اس آپٹیکل کراس سیکشن کی ہمیشہ ایک خاص موٹائی ہوتی ہے، جسے آپٹیکل پتلا سیکشن بھی کہا جاتا ہے۔ چونکہ فوکل پوائنٹ پر روشنی کی شدت نان فوکس پوائنٹ پر اس سے کہیں زیادہ ہوتی ہے، اور نان فوکل ہوائی جہاز کی روشنی کو پن ہول سے فلٹر کیا جاتا ہے، اس لیے کنفوکل سسٹم کے فیلڈ کی گہرائی تقریباً صفر ہے، اور اسکیننگ Z-axis آپٹیکل ٹوموگرافی کا ادراک کر سکتا ہے، مشاہدہ کیے جانے والے نمونے کے مرکوز جگہ پر ایک دو جہتی آپٹیکل سلائس بناتا ہے۔ XY طیارہ (فوکل پلین) اسکیننگ کو Z-axis (optical axis) اسکیننگ کے ساتھ ملا کر، نمونے کی سہ جہتی تصویر کو مسلسل تہوں کی دو جہتی تصاویر کو جمع کرکے اور خصوصی کمپیوٹر سافٹ ویئر کے ذریعے پروسیس کیا جا سکتا ہے۔
یعنی پتہ لگانے والا پن ہول اور روشنی کا منبع پن ہول ہمیشہ ایک ہی نقطہ پر مرکوز ہوتے ہیں، تاکہ فوکل ہوائی جہاز کے باہر پرجوش فلوروسینس پتہ لگانے والے پن ہول میں داخل نہ ہو سکے۔
لیزر کنفوکال کے کام کرنے والے اصول کا سادہ اظہار یہ ہے کہ یہ لیزر لائٹ کو روشنی کے منبع کے طور پر استعمال کرتا ہے۔ روایتی فلوروسینس مائیکروسکوپ امیجنگ کی بنیاد پر، اس میں ایک لیزر سکیننگ ڈیوائس اور کنجوگیٹ فوکسنگ ڈیوائس شامل کی گئی ہے، اور یہ کمپیوٹر کنٹرول کے ذریعے ڈیجیٹل امیج کے حصول اور پروسیسنگ کا نظام ہے۔
