لیزر سکیننگ ملٹی فوٹون مائیکروسکوپی کے بہتری کے فوائد
لیزر اسکیننگ ملٹی فوٹون مائکروسکوپی آپٹیکل مائکروسکوپی میں ایک اہم پیشرفت کی نمائندگی کرتی ہے۔ یہ زندہ خلیوں، فکسڈ سیلز اور ٹشوز میں گہرے ڈھانچے کا مشاہدہ کرنے کے قابل بناتا ہے، جبکہ واضح اور تیز کثیر پرتوں والے Z-طیارے کے ڈھانچے یعنی آپٹیکل سیکشنز کو پکڑتا ہے جو کہ نمونوں کی تین جہتی ٹھوس ساخت کی تعمیر نو کے لیے مزید استعمال کیے جا سکتے ہیں۔
ایک کنفوکل مائکروسکوپ لیزر لائٹ ماخذ کو اپناتا ہے۔ لیزر بیم کو معروضی لینس کے پچھلے فوکل طیارے کو مکمل طور پر روشن کرنے کے لیے بڑھایا جاتا ہے، پھر معروضی لینس کے نظام سے گزرتا ہے اور نمونے کے فوکل طیارے پر ایک انتہائی چھوٹے جگہ میں تبدیل ہو جاتا ہے۔ معروضی لینس کے عددی یپرچر پر منحصر ہے، روشن جگہ کا قطر تقریباً 0.25 سے 0.8 μm تک ہوتا ہے، جس کی محوری گہرائی تقریباً 0.5 سے 1.5 μm ہوتی ہے۔ کنفوکل اسپاٹ کا سائز مائکروسکوپ ڈیزائن، لیزر طول موج، معروضی خصوصیات، اسکیننگ یونٹ کی ترتیبات اور نمونہ کی خصوصیات سے طے ہوتا ہے۔
وسیع فیلڈ خوردبینوں میں روشنی کی ایک بڑی حد اور گہری روشنی کی گہرائی ہوتی ہے، جب کہ کنفوکل مائکروسکوپی روشنی کو فوکل ہوائی جہاز پر ایک عین فوکل پوائنٹ میں مرکوز کرتی ہے۔ کنفوکل مائیکروسکوپی کا بنیادی فائدہ موٹے فلوروسینٹ نمونوں (50 μm یا اس سے زیادہ) پر ٹھیک آپٹیکل سیکشننگ کرنے کی اس کی صلاحیت میں مضمر ہے، جس کے ہر حصے کی موٹائی 0.5 سے 1.5 μm تک ہوتی ہے۔
آپٹیکل سیکشن امیجز کا ایک سلسلہ نمونہ کو عمودی طور پر مائکروسکوپ کی درست Z-axis سٹیپنگ موٹر کے ذریعے منتقل کر کے حاصل کیا جاتا ہے۔ تصویری سگنل جمع کرنا سختی سے ٹارگٹڈ فوکل ہوائی جہاز تک محدود ہے اور نمونے کے اندر دیگر پوزیشنوں سے نکلنے والے سگنلز کی مداخلت سے پاک ہے۔ بیک گراؤنڈ فلوروسینس کو ختم کرنے اور سگنل ٹو شور کے تناسب کو بہتر بنانے کے بعد، کنفوکل امیجز روایتی وسیع فیلڈ فلوروسینس امیجز کے مقابلے میں نمایاں طور پر زیادہ کنٹراسٹ اور ریزولوشن کی نمائش کرتی ہیں۔
زیادہ تر نمونوں میں، پیچیدہ ساختی اجزاء ایک دوسرے سے مل کر پیچیدہ نظام بناتے ہیں۔ ایک بار جب کافی تعداد میں آپٹیکل سیکشنز اکٹھے ہو جائیں تو پیشہ ورانہ سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے سہ جہتی تعمیر نو کو مکمل کیا جا سکتا ہے۔ یہ تجرباتی طریقہ حیاتیاتی تحقیق میں وسیع پیمانے پر لاگو کیا گیا ہے تاکہ خلیات اور بافتوں کے درمیان پیچیدہ ساختی اور فعال تعلقات کو واضح کیا جا سکے۔
