مائکروسکوپک امیجنگ کلاس روم 丨 فلوروسینس مائکروسکوپی کا اطلاق
ٹوٹل انٹرنل ریفلیکشن فلوروسینس مائیکروسکوپی (TIRFM) ایک ایسی تکنیک ہے جو دو مختلف ریفریکٹیو انڈیکس میڈیا کے درمیان پھیلنے والی ہلکی بیم کے ذریعے پیدا ہونے والی ایوینسینٹ لہر کا استعمال کرتی ہے تاکہ فلوروسینٹ لیبل والے زندہ خلیوں کی سطح کی جانچ کی جاسکے۔ عملی طور پر، جب ایک واقعہ لیزر بیم کا سامنا کور سلپ اور خلیات پر مشتمل آبی میڈیم کے درمیان ہوتا ہے، تو یہ نازک زاویہ (کل اندرونی عکاسی) پر ظاہر ہوتا ہے۔ چونکہ evanescent لہر کی توانائی کورسلپ سے دوری کے ساتھ تیزی سے کم ہوتی ہے، صرف سطح کے 10 نینو میٹر (10 اور 200 نینو میٹر کے درمیان) کے اندر موجود فلوروفورس ہی evanescent لہر سے پرجوش ہوتے ہیں، جب کہ اس سے دور فلوروفورس بڑی حد تک غیر پرجوش ہوتے ہیں۔ متاثر۔ اس طرح، TIRFM کے نتیجے میں کور سلپ کے قریب واقع فلوروفورس سے سگنل کی اعلی سطح ہوتی ہے، جو ایک بہت ہی تاریک پس منظر پر لگائی جاتی ہے، جو ایک بہترین سگنل ٹو شور کا تناسب فراہم کرتا ہے۔ اتیجیت کی گہرائی کی انتہائی حد کورسلپ سطح کے قریب منسلک خلیوں میں واحد مالیکیولز یا جھلی اور آرگنیل کی ساخت کا مطالعہ کرنے کے لیے مثالی ہے (دیکھیں شکل 8(ای))۔ چونکہ جوش و خروش کور سلپ کے قریب پتلے علاقوں تک ہی محدود ہے، اس لیے فوٹو بلیچنگ اور فوٹو ٹوکسیٹی بھی ان خطوں تک ہی محدود ہے، جس سے TIRFM طویل مدتی مشاہدے کے لیے سب سے مفید طریقوں میں سے ایک ہے۔ سیل اور سالماتی حیاتیات میں مظاہر کی ایک وسیع رینج کا مطالعہ کرنے کے لیے تکنیک ایک بنیادی ذریعہ بن گئی ہے۔
Deconvolution ایک الگورتھم ہے جو آپٹیکل (Z) محور کے ساتھ حاصل کی گئی تمام فوکس امیجز کے سیٹ پر لاگو ہوتا ہے تاکہ تصویروں کے ڈھیر میں فوٹون سگنل کو ایک دیئے گئے امیج ہوائی جہاز یا ایک سے زیادہ فوکل طیاروں کے لیے بڑھایا جا سکے۔ نمونے کے فوکل طیاروں کے درمیان قطعی طور پر متعین وقفوں پر تصویر کے حصول کی ضمانت دینے کے لیے مائکروسکوپ کو اعلیٰ درستگی والی موٹرائزڈ فوکس ڈرائیوز سے لیس ہونا چاہیے۔ ایک عام ایپلی کیشن میں (دیکھیں تصویر 8(f))، deconvolution کا عمل وائیڈ فیلڈ فلوروسینس ایکسائٹیشن اور اخراج کا استعمال کرتے ہوئے دیے گئے فوکل ہوائی جہاز سے فوکس سے باہر کی روشنی کو دبلا اور ہٹانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ سب سے پیچیدہ ایپلی کیشن یہ ہے کہ ڈیکونولوشن کے عمل کو پورے امیج اسٹیک پر لاگو کیا جائے تاکہ متوقع نظارے یا 3D ماڈل تیار کیے جا سکیں۔ deconvolution کے لیے استعمال ہونے والی وائیڈ فیلڈ امیجز کا ایک سیٹ نمونے کے ذریعے خارج ہونے والے فوٹونز کی نظریاتی زیادہ سے زیادہ تعداد کو حاصل کرتا ہے۔ deconvolution عمل فوکل ہوائی جہاز کے اوپر اور نیچے خارج ہونے والے فوٹون کی "دھندلی" شدتوں کو اصل جہاز میں دوبارہ تقسیم کرتا ہے۔ اس طرح، deconvolution تقریباً تمام دستیاب اخراج کی شدتوں کو استعمال کرتا ہے اور ایک بہترین روشنی کا بجٹ فراہم کرتا ہے، جس سے اس تکنیک کو انتہائی ہلکے سے حساس نمونوں کے لیے انتخاب کا طریقہ بنایا جاتا ہے۔
فلوروسینس مائیکروسکوپی، فلوروسینس یا فرسٹر ریزوننس انرجی ٹرانسفر (FRET) پر گونج توانائی کی منتقلی کے رجحان کی ایک قسم زندہ خلیوں میں پروٹین، لپڈز، انزائمز اور نیوکلک ایسڈ کے پابند اور تعامل پر مقداری وقتی اور مقامی معلومات حاصل کرنے کے لیے استعمال ہوتی ہے۔ FRET مستقل حالت یا وقت سے حل شدہ تکنیکوں کو استعمال کر سکتا ہے، لیکن وقت کے ساتھ حل شدہ FRET امیجنگ میں عطیہ کنندہ قبول کرنے والے فاصلوں کو زیادہ واضح طور پر نقشہ کرنے کا فائدہ ہے۔ ایک معیاری وائیڈ فیلڈ فلوروسینس مائکروسکوپ جو مناسب جوش اور اخراج کے فلٹرز سے لیس ہے اور ایک حساس کیمرہ FRET امیجنگ کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے۔ بائیو سینسرز جو ماحولیاتی طور پر حساس پروٹین یا پیپٹائڈ کو دو FRET- قابل اطلاق فلوروسینٹ پروٹین کے درمیان سینڈوچ کرتے ہیں فی الحال سیل بائیولوجی میں بڑے پیمانے پر استعمال ہوتے ہیں۔ ان تحقیقات کو تناسب کے تجزیہ کے ساتھ مل کر حساس اخراج FRET تکنیک کا استعمال کرتے ہوئے وسیع فیلڈ فلوروسینس مائکروسکوپی کے تحت آسانی سے امیج کیا جاتا ہے۔ اس کے علاوہ، لیزر اسکیننگ کنفوکل مائیکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے اسپیکٹرل امیجنگ اور لکیری ان مکسنگ بائیو سینسرز اور دیگر فلوروسینٹ پروٹین ایپلی کیشنز میں FRET مظاہر کی نگرانی میں مدد کر سکتی ہے۔
فلوروسینس لائف ٹائم امیجنگ مائکروسکوپی (FLIM) ایک جدید ترین تکنیک ہے جو بیک وقت فلوروسینس لائف ٹائم اور امیج میں ہر مقام پر فلوروفور کے مقامی مقام کو ریکارڈ کرنے کی صلاحیت رکھتی ہے۔ یہ طریقہ ماحولیاتی پیرامیٹرز کا مطالعہ کرنے کے لیے ایک طریقہ کار فراہم کرتا ہے جیسے کہ pH، ionic ارتکاز، سالوینٹ قطبیت، noncovalent تعاملات، viscosity، اور اکیلے زندہ خلیوں میں آکسیجن تناؤ اور ڈیٹا کو مقامی اور عارضی صفوں میں پیش کرتا ہے۔ نینو سیکنڈ پیمانے پر پرجوش ریاست کی زندگی بھر کی FLIM پیمائش مقامی فلوروفور ارتکاز، فوٹو بلیچنگ اثرات، اور راستے کی لمبائی (نمونے کی موٹائی) سے آزاد ہیں، لیکن پرجوش ریاستی رد عمل جیسے کہ گونج توانائی کی منتقلی کے لیے حساس ہیں۔ درحقیقت، گونج توانائی کی منتقلی سے پہلے اور بعد میں فلوروسینٹ عطیہ دہندگان کی زندگی بھر کی تبدیلیوں کی نگرانی کرکے FLIM کو FRET کے ساتھ جوڑنا اس رجحان کا مطالعہ کرنے کا ایک بہترین طریقہ سمجھا جاتا ہے۔
فلوروسینٹلی لیبل والے میکرو مالیکیولس اور چھوٹے فلوروفورس کی نقل و حرکت (ٹرانسورس ڈفیوژن گتانک) کا تعین فوٹو بلیچنگ (FRAP) تکنیک کے بعد فلوروسینس ریکوری سے کیا جا سکتا ہے۔ FRAP میں، ایک بہت چھوٹا منتخب علاقہ (قطر میں چند مائکرو میٹر) کو شدت سے روشن کیا جاتا ہے، عام طور پر لیزر کے ذریعے، اس علاقے میں فلوروفور کی مکمل فوٹو بلیچنگ پیدا کرنے کے لیے۔ نتیجہ فلوروسینس کی ڈرامائی کمی یا فنا ہے۔ فوٹو بلیچنگ پلس کے بعد، بلیچ والے علاقوں میں فلوروسینس کی شدت کی وصولی کی شرح اور حد کو فلوروفور ریپوپولیشن اور ریکوری کے حرکیات کے بارے میں معلومات پیدا کرنے کے لیے کم جوش کی شدت پر وقت کے ایک فنکشن کے طور پر مانیٹر کیا گیا تھا (شکل 9)۔ FRAP عام طور پر EGFP یا دیگر فلوروسینٹ پروٹین کا استعمال کرتے ہوئے انجام دیا جاتا ہے۔ فوٹو ایکٹیویشن کی متعلقہ تکنیکیں خصوصی مصنوعی کیجڈ فلوروفورس یا اسی طرح کے فعال فلوروسینٹ پروٹین پر مبنی ہیں جنہیں UV یا وایلیٹ کی چھوٹی دالوں سے چالو کیا جا سکتا ہے۔ نقل و حرکت کے پیرامیٹرز کا تعین کرنے کے لیے فوٹو ایکٹیویشن اور ایف آر اے پی کو تکمیلی تکنیک کے طور پر استعمال کیا جا سکتا ہے۔
FRAP سے متعلق ایک تکنیک میں، جسے فوٹو بلیچنگ (FLIP) کے بعد فلوروسینس نقصان کہا جاتا ہے، ایک زندہ خلیے کے اندر ایک متعین فلوروسینٹ خطہ شدید شعاع ریزی کے ذریعے بار بار فوٹو لیچنگ سے گزرتا ہے۔ اگر تمام فلوروفورس اس علاقے میں پھیلنے کے قابل تھے جس کی پیمائش کی گئی مدت کے دوران فوٹو بلیچ کیا گیا تھا، تو اس کے نتیجے میں پورے سیل میں فلوروسینٹ سگنل کا مکمل نقصان ہو جائے گا۔ اس شرح کا حساب لگا کر جس پر پورے خلیے سے فلوروسینس غائب ہو جاتا ہے، ہدف فلوروفور کی بازی کی نقل و حرکت کا تعین کیا جا سکتا ہے۔ اس کے علاوہ، FLIP خلیات کے انفرادی حصوں کے درمیان کسی بھی پھیلاؤ والی رکاوٹوں کے مقام اور نوعیت کی آسانی سے شناخت کر سکتا ہے، جیسے کہ نیوران کے سوما اور ایکسون کے درمیان رکاوٹ۔
فلوروسینس کوریلیشن اسپیکٹروسکوپی (FCS)، جو بنیادی طور پر لیزر اسکیننگ کنفوکل مائیکروسکوپی یا ملٹی فوٹون مائیکروسکوپی میں استعمال ہوتی ہے، ایک ایسا طریقہ ہے جو حرکی معلومات کا تعین کرنے کے لیے ڈیزائن کیا گیا ہے جیسے کیمیکل ری ایکشن کی شرح، ڈفیوژن گتانک، مالیکیولر وزن، بہاؤ کی شرح اور جمع کے لیے تکنیک۔ FCS میں، ایک چھوٹا سا حجم (تقریباً ایک فیمٹومیٹر؛ لیزر کا پھیلاؤ محدود فوکس) کو ایک فوکسڈ لیزر بیم سے روشن کیا جاتا ہے تاکہ فلوروسینٹ مالیکیولز کی حرکیات کی وجہ سے فلوروسینٹ مالیکیولز کی حرکیات کی وجہ سے فلوورسنٹ کے زیر قبضہ حجم میں وقت کی ایک تقریب کے طور پر ریکارڈ کیا جا سکے۔ مالیکیولز (تصویر 10)۔ نسبتاً چھوٹے فلوروفورس روشن حجم میں تیزی سے پھیلتے ہیں، جس سے بے ترتیب شدت کے چھوٹے پھٹ پڑتے ہیں۔ اس کے برعکس، بڑے کمپلیکس (میکرو مالیکیولز کے پابند فلوروفورس) زیادہ آہستہ حرکت کرتے ہیں، طویل، زیادہ مستقل وقت پر منحصر فلوروسینس کی شدت کے نمونے پیدا کرتے ہیں۔
جب فلوروسینٹ لیبل والے ڈھانچے جاندار خلیوں کے مخصوص خطوں میں گھنے پیک اور اوورلیپ ہوتے ہیں، تو ان کی حرکیات اور مقامی تقسیم کا تجزیہ کرنا مشکل ہوتا ہے۔ فلوروسینس اسپاٹ مائیکروسکوپی (FSM) ایک ایسی تکنیک ہے جو تقریباً تمام امیجنگ طریقوں کے ساتھ مطابقت رکھتی ہے جو فلوروسینٹ لیبل والے ذیلی یونٹس کی بہت کم ارتکاز کا فائدہ اٹھاتی ہے، فوکس سے باہر فلوروسینس کو کم کرتی ہے، اور گھنے خطوں میں لیبل والے ڈھانچے اور ان کی حرکیات کی مرئیت کو بہتر بناتی ہے۔ FSMs کو دلچسپی کے پورے ڈھانچے کے صرف ایک حصے پر لیبل لگا کر لاگو کیا جاتا ہے۔ اس لحاظ سے، FSM پورے میدان میں FCS کو انجام دینے کے مترادف ہے، حالانکہ یہ مقداری وقتی تجزیہ کے بجائے مقامی نمونوں پر زیادہ زور دیتا ہے۔ فلوروسینٹ اسپاٹ مائیکروسکوپی خاص طور پر ہائپر ایکٹیو خلیوں میں سائٹوسکیلیٹل عناصر جیسے ایکٹین اور مائکروٹوبولس کی نقل و حرکت اور جمع کا تعین کرنے میں مفید ہے۔
محرک اخراج کمی مائیکروسکوپی (STED) ایک ابھرتی ہوئی سپر ریزولوشن تکنیک ہے جس میں مقامی ریزولیوشن پھیلاؤ کی حد سے کہیں زیادہ ہے، جس میں انگوٹھی کی شکل والی ختم ہونے والی روشنی کا استعمال کرتے ہوئے حوصلہ افزائی کی روشنی کے ایک چھوٹے شہتیر کو گھیر لیا جاتا ہے تاکہ ذیلی-50 nm آن محور حاصل کیا جا سکے۔ قرارداد یہ تکنیک مطابقت پذیر لیزر دالوں اور مقامی طور پر مربوط سرکلر STED دالوں کے ساتھ فلوروفورس کے جوش پر انحصار کرتی ہے جو خارج ہونے والی روشنی کو ختم کرتی ہے، لیزر اسکیننگ فوکس کے ارد گرد پرجوش مالیکیولز کے فلوروسینس کو دباتی ہے۔ اسپاٹ کے دائرہ میں پیدا ہونے والے فلوروسینس کو دبایا جاتا ہے، لیکن جگہ کے مرکز میں نہیں، اس طرح فلوروسینٹ جگہ کے سائز کو نمایاں طور پر کم کیا جاتا ہے اور اسی طرح ریزولوشن میں نمایاں اضافہ ہوتا ہے۔ STED زندہ خلیوں کی ہائی ریزولوشن کا پتہ لگانے کے لیے ایک کارآمد ٹول ثابت ہوا ہے۔ دیگر ابھرتی ہوئی سپر ریزولوشن تکنیک، جیسے فوٹو ایکٹیویٹڈ لوکلائزیشن مائیکروسکوپی (PALM) اور سٹرکچرڈ لائٹ الیومینیشن مائکروسکوپی (SIM) بھی مستقبل قریب میں لائیو سیل امیجنگ کے لیے بنیادی ٹولز بن جائیں گی۔
جینیاتی طور پر انکوڈ شدہ فلوروسینٹ پروٹینز اور لائیو سیل امیجنگ کے لیے جدید مصنوعی فلوروفورس کا بڑھتا ہوا استعمال دنیاوی حرکیات اور مقامی تعلقات کی نگرانی کے لیے نئے آپٹیکل طریقوں کا دروازہ کھولتا ہے۔ مائکروسکوپسٹس کے پاس اب ٹولز کا ایک مکمل سیٹ موجود ہے جس سے سیلولر پروسیسز کی تصویری ڈیٹا کو دیکھنے اور ریکارڈ کرنے کے لیے ٹائم اسکیلز کی ایک وسیع رینج اور ایک سے زیادہ ریزولوشنز پر ہوتا ہے۔ لیزر اسکیننگ کنفوکل مائیکروسکوپی کا استعمال کرتے ہوئے سست واقعات کو آسانی سے دیکھا اور ریکارڈ کیا جا سکتا ہے، جب کہ اسپننگ ڈسک ٹیکنالوجی کا استعمال کرتے ہوئے تیز رفتار کائنےٹک واقعات حاصل کیے جا سکتے ہیں۔ اس کے علاوہ، ملٹی فوٹون مائیکروسکوپی موٹی بافتوں میں گہری امیجنگ کے قابل بناتی ہے، اور کل اندرونی عکاسی کی تکنیکیں جھلی کی سطحوں کو کنفوکل درستگی کے ساتھ جانچنے کے قابل بناتی ہیں۔ اعلی درجے کے فلوروسینس طریقے، جیسے FRET، FLIM، FRAP، FCS، FSM، SIM، PALM، اور STED، کو ریزولوشنز پر پروٹین-پروٹین کے تعاملات کی نگرانی کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے جو کہ تفاوت کی حد کے ذریعے اجازت دی گئی ہے۔ فلوروفور، مائیکروسکوپ اور ڈیٹیکٹر ٹیکنالوجی میں ترقی کے ساتھ، ایک وسیع دنیا کو "مائیکروسکوپ کے نیچے" لایا جائے گا۔
