ملٹی فوٹون مائکروسکوپی امیجنگ: ویوو میں نیوران کی امیجنگ کے لیے متنوع تکنیک
روایتی سنگل فوٹون وائڈ فیلڈ فلوروسینس مائکروسکوپ کے مقابلے میں، ملٹی فوٹون مائکروسکوپی (MPM) میں آپٹیکل سیکشننگ اور گہری امیجنگ کے کام ہوتے ہیں۔ 2019 میں، Jerome Lecoq et al. تین پہلوؤں سے متعلقہ MPM ٹیکنالوجی پر تبادلہ خیال کیا: دماغ میں گہرائی میں نیورون امیجنگ، بڑے پیمانے پر نیوران امیجنگ، اور تیز رفتار نیوران امیجنگ۔
نیوران کی سرگرمی کو پیچیدہ رویے سے جوڑنے کے لیے، عام طور پر گہرے پرانتستا میں نیوران کی تصویر بنانا ضروری ہوتا ہے، جس کے لیے MPM کو گہری امیجنگ کی صلاحیت کی ضرورت ہوتی ہے۔ اتیجیت اور اخراج کی روشنی حیاتیاتی بافتوں کے ذریعے بہت زیادہ بکھری ہوئی اور جذب ہو جائے گی، جو MPM کی امیجنگ گہرائی کو محدود کرنے کا بنیادی عنصر ہے۔ اگرچہ بکھرنے کا مسئلہ لیزر کی شدت میں اضافہ کر کے حل کیا جا سکتا ہے، لیکن یہ دیگر مسائل لائے گا، جیسے نمونے کو جلانا، ڈی فوکس کرنا اور سطح کے قریب فلوروسینٹ جوش۔ MPM امیجنگ کی گہرائی میں اضافہ کرنے کا بہترین طریقہ یہ ہے کہ لمبی طول موج کو اتیجیت روشنی کے طور پر استعمال کیا جائے۔
اس کے علاوہ، دو فوٹوون (2P) امیجنگ کے لیے، توجہ سے باہر اور قریب کی سطح کی فلوروسینس جوش دو سب سے بڑے گہرائی کو محدود کرنے والے عوامل ہیں، جب کہ تھری فوٹوون (3P) امیجنگ کے لیے، یہ دونوں مسائل بہت کم ہو جاتے ہیں، لیکن فلوروسینس کی وجہ سے تھری فوٹوون امیجنگ گروپ کا جذب کراس سیکشن 2P کے مقابلے میں بہت چھوٹا ہے، لہذا اسی شدت کے فلوروسینس سگنل کو حاصل کرنے کے لیے جس میں 2P سے حوصلہ افزائی ہوتی ہے، زیادہ پلس انرجی کے آرڈر کی ضرورت ہوتی ہے۔ فنکشنل 3P مائیکروسکوپی ساختی 3P مائیکروسکوپی کے مقابلے میں زیادہ مطالبہ کرتی ہے، جس کے لیے بروقت نیورونل سرگرمی کا نمونہ لینے کے لیے تیزی سے اسکیننگ کی ضرورت ہوتی ہے۔ ہر پکسل کے رہنے کے وقت کے اندر کافی سگنل جمع کرنے کے لیے زیادہ نبض کی توانائی کی ضرورت ہوتی ہے۔
پیچیدہ طرز عمل میں اکثر مقامی اور طویل فاصلے کے کنکشن کے ساتھ بڑے دماغی نیٹ ورکس شامل ہوتے ہیں۔ نیوران کی سرگرمی کو رویے سے جوڑنے کے لیے، ایک ہی وقت میں بہت بڑے اور وسیع پیمانے پر تقسیم شدہ نیوران کی سرگرمی کی نگرانی کرنا ضروری ہے۔ دماغ میں اعصابی نیٹ ورک دسیوں ملی سیکنڈ کے اندر اندر آنے والی محرکات پر کارروائی کرتا ہے۔ اس تیز اعصابی نیٹ ورک کو سمجھنے کے لیے نیوران کی حرکیات کا مطالعہ کرنے کے لیے، MPM کو نیوران کی تیزی سے تصویر کشی کرنے کی صلاحیت کا ہونا ضروری ہے۔ تیز رفتار MPM طریقوں کو سنگل بیم سکیننگ تکنیک اور ملٹی بیم سکیننگ تکنیک میں تقسیم کیا جا سکتا ہے۔
سنگل بیم اسکیننگ ٹیکنالوجی ایک بڑے فیلڈ آف ویو (FOV) کے ساتھ عصبی بافتوں کے تیز رفتار ٹراورسل کو قابل بناتی ہے۔
ایم پی ایم کا استعمال کرتے وقت نیوران کی تصویر بنانے کے لیے، بے ترتیب رسائی کی اسکیننگ - یعنی لیزر بیم کو کسی بھی منتخب نقطہ نظر پر فوری طور پر اسکین کیا جاتا ہے - صرف دلچسپی کے نیوران کو اسکین کرسکتا ہے، جو نہ صرف بغیر لیبل والے عصبی ریشوں کو اسکین کرنے سے گریز کرتا ہے۔ لیزر بیم کے اسکیننگ کے وقت کو بھی بہتر بنائیں۔ بے ترتیب رسائی سکیننگ (تصویر 1) کو ایک ایکوسٹو آپٹک ڈیفلیکٹر (AOD) کے ساتھ حاصل کیا جا سکتا ہے، جو ایک پیزو الیکٹرک ٹرانسڈیوسر کو ریڈیو فریکوئنسی سگنل کے ساتھ ایک مناسب کرسٹل سے جوڑ کر کام کرتا ہے۔ نتیجے میں آنے والی صوتی لہریں وقفے وقفے سے ریفریکٹیو انڈیکس گریٹنگ کا باعث بنتی ہیں، تفاوت اس وقت ہوتا ہے جب ایک لیزر بیم ایک جھنڈی سے گزرتی ہے۔ صوتی لہر کی شدت اور فریکوئنسی کو ریڈیو فریکوئنسی برقی سگنل کے ذریعے ایڈجسٹ کیا جا سکتا ہے تاکہ منتشر روشنی کی شدت اور سمت کو تبدیل کیا جا سکے، تاکہ ایک جہتی افقی صوابدیدی پوائنٹ سکیننگ کو ایک AOD استعمال کرکے محسوس کیا جا سکے، اور 3D کو محسوس کیا جا سکے۔ دیگر محوری سکیننگ ٹیکنالوجیز کے ساتھ مل کر AODs کا ایک جوڑا استعمال کر کے بے ترتیب رسائی سکیننگ۔ تاہم، یہ تکنیک نمونے کی حرکت کے لیے بہت حساس ہے اور حرکت کے نمونے کا شکار ہے۔ فی الحال، فاسٹ راسٹر سکیننگ، یعنی FOV میں پروگریسو سکیننگ، بڑے پیمانے پر استعمال کی جاتی ہے کیونکہ الگورتھم آسانی سے حرکت کے نمونوں کو حل کر سکتا ہے۔
Vivo میں نیوکورٹیکل L2/3 نیوران کی AOD پر مبنی دو فوٹون امیجنگ[2]
تیز راسٹر اسکیننگ کو محسوس کرنے کے بہت سے طریقے ہیں، تیز 2D اسکیننگ کے لیے وائبریٹنگ آئینے کا استعمال کرتے ہوئے، تیز تھری ڈی اسکیننگ کے لیے وائبریٹنگ آئینے اور ایک ایڈجسٹ الیکٹرک لینس کو یکجا کرنا، لیکن ایڈجسٹ ایبل الیکٹرک لینس محوری سمت میں تیزی سے فوکس نہیں کر سکتا۔ مکینیکل جڑتا سوئچنگ، جو امیجنگ کی رفتار کو متاثر کرتی ہے، کو اب ایک مقامی لائٹ ماڈیولیٹر (SLM) سے تبدیل کیا جا سکتا ہے۔
ریموٹ فوکسنگ بھی 3D امیجنگ حاصل کرنے کا ایک ذریعہ ہے، جیسا کہ شکل 2 میں دکھایا گیا ہے۔ LSU ماڈیول میں، اسکیننگ گیلوانومیٹر افقی طور پر اسکین کرتا ہے، اور ASU ماڈیول میں مقصدی لینس L1 اور آئینہ M شامل ہوتا ہے، اور محوری اسکیننگ کو ایڈجسٹ کرکے محسوس کیا جاتا ہے۔ ایم کی پوزیشن۔ یہ تکنیک نہ صرف بنیادی مقصد لینس L2 کے ذریعہ متعارف کرائے گئے آپٹیکل خرابی کو درست کرسکتی ہے بلکہ تیز محوری اسکیننگ کو بھی قابل بناتی ہے۔ مزید نیوران امیجنگ حاصل کرنے کے لیے، FOV کو خوردبین کے معروضی لینس ڈیزائن کو ایڈجسٹ کرکے بڑا کیا جا سکتا ہے، لیکن بڑے NA اور بڑے FOV والے معروضی لینس عموماً بھاری ہوتے ہیں اور تیز محوری سکیننگ کے لیے تیزی سے حرکت نہیں کر سکتے، اس لیے بڑے FOV سسٹمز Telefocus پر انحصار کرتے ہیں۔ ، SLM اور ایڈجسٹ موٹرائزڈ لینز۔
ریموٹ فوکسنگ ٹو فوٹون امیجنگ سسٹم کا اسکیمیٹک ڈایاگرام
This technique3 typically uses two independent paths for imaging two distant (>1-2 ملی میٹر کے علاوہ) امیجنگ سائٹس (تصویر 3C،D)؛ ملحقہ علاقوں کے لیے، یہ عام طور پر امیجنگ کے لیے ایک ہی معروضی لینس کے متعدد بیم استعمال کرتا ہے (تصویر 3E،F)۔ ملٹی بیم اسکیننگ تکنیک کو ایکسائٹیشن بیم کے درمیان کراس اسٹالک کے مسئلے پر خصوصی توجہ دینی چاہیے، جسے پوسٹ لائٹ سورس سیپریشن طریقہ یا اسپیس ٹائم ملٹی پلیکسنگ طریقہ سے حل کیا جاسکتا ہے۔ پوسٹ ہاک لائٹ سورس علیحدگی کا طریقہ کراسسٹالک کو ختم کرنے کے لیے بیم کو الگ کرنے کے لیے الگورتھم کے استعمال سے مراد ہے۔ ٹائم اسپیس ملٹی پلیکسنگ طریقہ سے مراد ایک سے زیادہ اتیجیت شہتیروں کا بیک وقت استعمال ہوتا ہے، ہر بیم کی دالیں وقت میں تاخیر کا شکار ہوتی ہیں، تاکہ مختلف بیموں سے پرجوش انفرادی شہتیروں کو عارضی طور پر الگ کیا جا سکے۔ فلوروسینٹ سگنل مزید شہتیروں کو متعارف کروا کر مزید نیوران کی تصویر کشی کی جا سکتی ہے، لیکن ایک سے زیادہ شہتیر فلوروسینس کے زوال کے وقت کے اوورلیپ کو بڑھا دیں گے، جو سگنل کے ذرائع میں فرق کرنے کی صلاحیت کو محدود کر دیتا ہے۔ اور ملٹی پلیکسنگ کا الیکٹرانک آلات کے کام کرنے کی رفتار پر منفی اثر پڑتا ہے۔ اعلی ضروریات؛ شہتیروں کی ایک بڑی تعداد کو ایک بیم کے تقریباً سگنل ٹو شور کے تناسب کو برقرار رکھنے کے لیے زیادہ لیزر پاور کی بھی ضرورت ہوتی ہے، جو آسانی سے ٹشو کو نقصان پہنچا سکتی ہے۔
بڑے ایریا امیجنگ ٹیکنالوجی
حالیہ برسوں میں، مختلف MPM ٹیکنالوجیز کی ترقی نے ہماری عصبی بافتوں کی امیجنگ کا دائرہ وسیع کر دیا ہے، جس سے ہمیں دماغ میں گہرائی میں مزید نیورانوں کی تیز رفتاری سے تصویر بنانے کی اجازت ملتی ہے، جس نے نیورو سائنس کی تحقیق کو بہت فروغ دیا ہے اور ہمیں ایک واضح فہم حاصل کرنے کے قابل بنایا ہے۔ دماغ کی تقریب.
