داغ لگانے کی تکنیک اور مائکروجنزموں کا خوردبین مشاہدہ
بیکٹیریا کا سادہ داغ
1 مقاصد
1.1 مائکروبیل سمیر اور سٹیننگ کی بنیادی تکنیکوں کو سیکھنے کے لیے۔
1.2 بیکٹیریا کے داغ لگانے کے سادہ طریقے پر عبور حاصل کرنا۔
1.3 بیکٹیریا کی مورفولوجیکل خصوصیات کو جاننا، اور تیل کے آئینے اور ایسپٹک آپریشن کی تکنیک کے استعمال کے سیکھنے کو مضبوط کرنا۔
2 اصول مائکرو بایولوجی کے تجربات میں بیکٹیریا کا سمیر اور داغ لگانا ایک بنیادی تکنیک ہے۔ بیکٹیریا کے خلیے چھوٹے اور شفاف ہوتے ہیں، انہیں عام روشنی خوردبین کے نیچے پہچاننا آسان نہیں ہوتا، اور ان پر داغ ہونا ضروری ہے۔ بیکٹیریا کو داغدار کرنے کے لیے ایک ہی رنگ کا استعمال، تاکہ داغ دار حیاتیات اور پس منظر میں واضح رنگ کا فرق پیدا ہو، تاکہ ان کی شکل اور ساخت کو زیادہ واضح طور پر دیکھا جا سکے۔ یہ طریقہ انجام دینے میں آسان ہے اور حیاتیات کی عمومی شکل اور بیکٹیریا کی ترتیب کے مشاہدے کے لیے موزوں ہے۔ الکلائن رنگوں کو عام طور پر سادہ داغ لگانے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے، کیونکہ غیر جانبدار، الکلائن یا کمزور تیزابی محلول میں، بیکٹیریل خلیات عام طور پر منفی طور پر چارج ہوتے ہیں، اور جب الکلائن رنگوں کو آئنائز کیا جاتا ہے، تو ان کے مالیکیولز کے داغ دار حصے پر مثبت چارج ہوتا ہے، اس لیے الکلائن رنگوں کا داغ دار حصہ بیکٹیریا کو رنگین بنانے کے لیے آسانی سے بیکٹیریا سے جکڑ سکتے ہیں۔ داغ دار بیکٹیریل خلیات پس منظر کے ساتھ تیزی سے متضاد ہیں اور خوردبین کے نیچے پہچاننا آسان ہے۔ عام طور پر سادہ داغ لگانے کے لیے استعمال ہونے والے رنگوں میں میروسیانائن نیلا، کرسٹل وایلیٹ اور بنیادی مرکب سرخ شامل ہیں۔ جب چینی کی بیکٹیریل گلنے سے تیزاب پیدا ہوتا ہے تاکہ میڈیم کا پی ایچ کم ہوجائے، بیکٹیریا کا مثبت چارج بڑھ جاتا ہے، اور پھر اسے سرخ، تیزابی سرخ یا کانگو سرخ اور دیگر تیزابی رنگوں کے داغ میں استعمال کیا جاسکتا ہے۔ داغ لگنے سے پہلے بیکٹیریا کو ٹھیک کرنا ضروری ہے۔ اس کا مقصد دو گنا ہے: ایک بیکٹیریا کو مارنا اور بیکٹیریا کو سلائیڈ پر لگانا؛ دوسرا رنگ کے لیے اس کی وابستگی کو بڑھانا ہے۔ عام طور پر دو طریقے استعمال کیے جاتے ہیں: حرارتی اور کیمیائی فکسشن۔ ٹھیک کرتے وقت خلیوں کی اصل شکل کو برقرار رکھنے کی کوشش کریں۔
3 مواد
3.1 سٹرین بیسیلس سبٹیلس 12-18h نیوٹرینٹ ایگر سلانٹ کلچر، اسٹیفیلوکوکس اوریئس تقریباً 24 گھنٹے نیوٹرینٹ ایگر سلانٹ کلچر، ایسچریچیا کولی 24 ایچ نیوٹرینٹ ایگر سلانٹ کلچر، بیکرز یسٹ ایگر سلانٹ کلچر۔
3.2 سٹین لو کا الکلائن میتھیلین بلیو سٹین (یا امونیم آکسیلیٹ کرسٹل وایلیٹ سٹین)، کاربولک ایسڈ کمپاؤنڈ سرخ داغ۔
3.3 آلات یا دیگر سامان خوردبین، الکحل کا لیمپ، سلائیڈ، ٹیکہ کی انگوٹھی، سلائیڈ ہولڈر، دو تہوں والی بوتل (دیودار کے تیل اور زائلین سے بھری ہوئی)، مائیکرو اسکوپ پیپر، فزیولوجیکل نمکین یا ڈسٹل واٹر وغیرہ۔
4 طریقہ کار سمیر → ڈرائینگ → فکسیشن → سٹیننگ → واشنگ → ڈرائینگ → مائکروسکوپک امتحان۔
5 مراحل
5.1 سمیر دو صاف اور تیل سے پاک سلائیڈیں لیں، جن میں سے ہر ایک سلائیڈ کے بیچ میں نمکین (یا کشید پانی) کے ایک چھوٹے قطرے کے ساتھ سیپٹک حالات میں، ایک ٹیکہ لگانے والی انگوٹھی کے ساتھ، بالترتیب، Bacillus subtilis، Garcinia micrococcus سے۔ اور Escherichia coli پانی کے قطرے میں تھوڑا سا کائی لینے کے لیے ترچھا، مکس کر کے فلم کے ساتھ لیپت کریں۔ اگر بیکٹیریل سسپنشن (یا مائع کلچر) سمیر، انگوٹی کو ٹیکہ لگانے کے لیے استعمال کیا جا سکتا ہے پک 2 سے 3 بجتی سلائیڈ پر براہ راست۔ نوٹ کریں کہ نمکین (آست پانی) اور بیکٹیریا کو زیادہ نہیں ہونا چاہئے اور یکساں طور پر پھیلنا چاہئے، زیادہ گاڑھا نہیں ہونا چاہئے۔
5.2 کمرے کے درجہ حرارت پر قدرتی طور پر خشک کرنا۔ اسے الکحل کے لیمپ کے اوپر لیپت سائیڈ کے ساتھ تھوڑا سا گرم کرکے بھی خشک کیا جاسکتا ہے۔ تاہم، شعلے کے زیادہ قریب نہ جائیں، کیونکہ درجہ حرارت بہت زیادہ ہونے سے بیکٹیریا کی مورفولوجی تباہ ہو جاتی ہے۔
5.3 فکسیشن اگر ہیٹ ڈرائینگ کا استعمال کیا جاتا ہے، تو فکسیشن اور ڈرائینگ کو ایک ہی قدم میں اسی طرح ملایا جاتا ہے جس طرح خشک ہونا۔ سمیر، خشک اور گرمی ٹھیک کریں.
5.4 سٹیننگ سلائیڈ کو سلائیڈ شیلف پر فلیٹ رکھیں، سمیر پر سٹیننگ سلوشن کے 1 سے 2 قطرے ڈالیں (سٹیننگ سلوشن صرف سمیر فلم کو ڈھانپتا ہے مناسب ہے)۔ سمیر کو Lü کے بنیادی میلانوکس بلیو سے 1~2 منٹ تک، اور کاربونیٹ ریڈ (یا امونیم آکسالیٹ کرسٹل وایلیٹ) سے تقریباً 1 منٹ تک داغ دیں۔
5.5 کلی کرنا داغدار محلول کو ڈالیں اور سلائیڈ کے ایک سرے سے نلکے کے پانی سے آہستہ سے اس وقت تک کللا کریں جب تک کہ سمیر سے گرنے والا پانی بے رنگ نہ ہو۔ کلی کرتے وقت، لیپت سطح کو دھونے کے لیے پانی کو براہ راست بہنے نہ دیں۔ سمیر فلم کو خارج ہونے سے بچنے کے لیے پانی کا بہاؤ بہت تیز یا بہت بڑا نہیں ہونا چاہیے۔
5.6 خشک کرنا قدرتی طور پر خشک ہونے کے لیے سلائیڈ پر موجود پانی کی بوندوں کو ہلائیں، خشک کو جذب کرنے کے لیے بلو ڈرائی یا جاذب کاغذ کا استعمال کیا جا سکتا ہے (ہوشیار رہیں کہ بیکٹیریا کے جسم کو صاف نہ کریں)۔ 5.7 خوردبینی معائنہ سمیر کو خشک کیا جاتا ہے اور مائیکروسکوپی کے ذریعے جانچا جاتا ہے۔ تیل کی خوردبین سے مشاہدہ کرنے سے پہلے سمیر کو مکمل طور پر خشک ہونا چاہیے۔
6 نتائج سنگل سٹیننگ کے بعد E. coli اور Micrococcus garciniae کی مورفولوجی بنائیں۔
چنے کی داغ
1 مقصد
1.1 گرام داغ کے اصول اور بیکٹیریا کی درجہ بندی اور شناخت میں اس کی اہمیت کو سمجھنا۔
1.2 گرام داغ لگانے کی تکنیک کو سیکھنے اور اس میں مہارت حاصل کرنے کے لیے اور لائٹ مائکروسکوپ کے آئل لینس کے استعمال کے سیکھنے کو مضبوط کرنا۔
