دو فوٹون فلوروسینس مائکروسکوپی کے بہت سے فوائد ہیں۔
1) لمبی طول موج کی روشنی مختصر طول موج کی روشنی کے مقابلے میں بکھرنے سے کم متاثر ہوتی ہے اور نمونے میں آسانی سے داخل ہو سکتی ہے۔
2) فوکل ہوائی جہاز کے باہر فلوروسینٹ مالیکیولز پرجوش نہیں ہوتے ہیں، جس سے زیادہ جوش کی روشنی فوکل ہوائی جہاز تک پہنچ سکتی ہے، جوش کی روشنی کو گہرے نمونوں میں گھسنے کی اجازت دیتا ہے۔
3) لمبی طول موج کے قریب اورکت روشنی مختصر طول موج کی روشنی کے مقابلے میں خلیات کے لیے کم زہریلی ہے۔
4) دو فوٹون مائکروسکوپ کا استعمال کرتے ہوئے نمونوں کا مشاہدہ کرتے وقت، فوٹو بلیچنگ اور فوٹو ٹوکسٹی صرف فوکل ہوائی جہاز پر ہوتی ہے۔ لہذا، دو فوٹون خوردبینیں موٹے نمونوں کے مشاہدے کے لیے، زندہ خلیوں کے مشاہدے کے لیے، یا فکسڈ پوائنٹ فوٹو بلیچنگ تجربات کرنے کے لیے سنگل فوٹوون خوردبین سے زیادہ موزوں ہیں۔
کنفوکل فلوروسینس مائکروسکوپی کے بارے میں علم
کنفوکل فلوروسینس مائیکروسکوپی کا بنیادی اصول: فوکل ہوائی جہاز پر ایک چھوٹا، اچھی طرح سے طے شدہ روشنی کی جگہ بنانے کے لیے نمونہ کو روشن کرنے کے لیے ایک پوائنٹ لائٹ سورس کا استعمال کریں۔ روشن ہونے کے بعد اس جگہ سے خارج ہونے والے فلوروسینس کو معروضی عینک کے ذریعے جمع کیا جاتا ہے اور اصل الیومینیشن لائٹ پاتھ کے ساتھ ڈائیکروک آئینے میں لوٹا دیا جاتا ہے۔ ایک بیم سپلٹر تشکیل دیں. سپیکٹرومیٹر فلوروسینس کو براہ راست پکڑنے والے کو بھیجتا ہے۔ روشنی کے منبع اور پکڑنے والے کے سامنے ایک پن ہول ہوتا ہے، جسے بالترتیب الیومینیشن پن ہول اور ڈیٹیکشن پن ہول کہتے ہیں۔ دونوں کی ہندسی جہتیں یکساں ہیں، تقریباً 100-200nm; فوکل ہوائی جہاز پر روشنی کے نقطہ کی نسبت، دونوں ایک دوسرے سے جڑے ہوئے ہیں، یعنی روشنی کا نقطہ عینکوں کی ایک سیریز سے گزرتا ہے اور بالآخر ایک ہی وقت میں الیومینیشن پن ہول اور ڈیٹیکشن پن ہول پر فوکس کیا جا سکتا ہے۔ اس طرح، فوکل ہول کی روشنی کو پتہ لگانے والے سوراخ کے اندر مرتکز کیا جا سکتا ہے، جبکہ فوکل ہول کے اوپر یا نیچے سے بکھری ہوئی روشنی کو پتہ لگانے والے سوراخ کے باہر بلاک کر دیا جاتا ہے اور اس کی تصویر نہیں بنائی جا سکتی۔ نمونے کو لیزر کے ساتھ پوائنٹ بہ پوائنٹ سکین کیا جاتا ہے، اور پتہ لگانے والے پن ہول کے پیچھے فوٹو ملٹی پلیئر ٹیوب بھی متعلقہ لائٹ پوائنٹ پوائنٹ کی کنفوکل امیج بذریعہ پوائنٹ حاصل کرتی ہے، جسے ڈیجیٹل سگنل میں تبدیل کر کے کمپیوٹر پر منتقل کیا جاتا ہے، اور آخر میں جمع کیا جاتا ہے۔ اسکرین پر پورے فوکل ہوائی جہاز کی واضح کنفوکل امیج میں۔ .
ہر فوکل ہوائی تصویر دراصل نمونے کا ایک نظری کراس سیکشن ہے۔ اس آپٹیکل کراس سیکشن کی ہمیشہ ایک خاص موٹائی ہوتی ہے اور اسے آپٹیکل پتلا سیکشن بھی کہا جاتا ہے۔ چونکہ فوکس پر روشنی کی شدت غیر فوکس پر روشنی کی شدت سے بہت زیادہ ہے، اور غیر فوکل ہوائی جہاز کی روشنی کو پن ہول سے فلٹر کیا جاتا ہے، اس لیے کنفوکل سسٹم کے فیلڈ کی گہرائی تقریباً صفر ہے۔ Z-axis سمت کے ساتھ اسکین کرنے سے آپٹیکل ٹوموگرافی کا احساس ہو سکتا ہے، جس سے نمونے کے مرکوز جگہ پر مطلوبہ دو جہتی آپٹیکل سیکشن کا مشاہدہ کیا جا سکتا ہے۔ XY طیارہ (فوکل طیارہ) اسکیننگ کو Z-axis (optical axis) اسکیننگ کے ساتھ ملا کر، دو جہتی تصاویر کی مسلسل سطحوں کو جمع کرکے اور خصوصی کمپیوٹر سافٹ ویئر کے ساتھ ان پر کارروائی کرکے، نمونے کی تین جہتی تصویر حاصل کی جاسکتی ہے۔
یعنی پتہ لگانے والا پن ہول اور روشنی کا منبع پن ہول ہمیشہ ایک ہی نقطہ پر مرکوز ہوتے ہیں، تاکہ فوکس ہوائی جہاز کے باہر پرجوش فلوروسینس پتہ لگانے والے پن ہول میں داخل نہ ہو سکے۔
لیزر کنفوکل کے کام کرنے والے اصول کا سادہ اظہار یہ ہے کہ یہ لیزر کو روشنی کے منبع کے طور پر استعمال کرتا ہے۔ روایتی فلوروسینس مائیکروسکوپ امیجنگ کی بنیاد پر، ایک لیزر سکیننگ ڈیوائس اور کنجوگیٹ فوکس کرنے والا آلہ شامل کیا جاتا ہے، اور ڈیجیٹل امیجز کو جمع کرنے اور اس پر کارروائی کرنے کے لیے سسٹم کو کمپیوٹر کے ذریعے کنٹرول کیا جاتا ہے۔
