شیشے کی سلائیڈوں کے لیے آپٹیکل مائکروسکوپ موٹائی کے تقاضے
مائیکروسکوپک ڈی ہائیڈریشن اور سیمپل اٹیچمنٹ: بار بار سینٹرفیوگریشن کی وجہ سے سیلز ضائع ہو جاتے ہیں، اس لیے بہتر ہے کہ آپٹیکل مائکروسکوپی کے لیے سیلز کو شیشے کی سلائیڈ یا پلاسٹک شیٹ کی سطح سے جوڑ دیا جائے، تاکہ سیلز ڈی ہائیڈریشن ہو جائیں اور شیشے کے ساتھ مل کر خشک ہو جائیں۔ سلائڈ یا پلاسٹک شیٹ. آپٹیکل مائیکروسکوپی میں شیشے کی سلائیڈوں کی موٹائی کے تقاضے خلیات کو شیشے کی سلائیڈوں یا پلاسٹک کی چادروں سے جوڑنے کی اجازت دینے کے لیے، سب سے پہلے شیشے کی سلائیڈوں یا پلاسٹک کی چادروں پر فلم کی ایک تہہ ڈالنا ضروری ہے۔ فلم بچھانے کا طریقہ درج ذیل ہے:
(1) آپٹیکل مائیکروسکوپی کا سب سے آسان طریقہ یہ ہے کہ پولی وینیل فارمل (فارمول) فلم کی ایک پتلی تہہ ڈالی جائے۔ صاف شدہ سلائیڈوں کو (0.5-1) فیصد پولی وینیل رسمی کلوروفارم محلول میں بھگو دیں۔ ماحول کے اتار چڑھاؤ کے بعد، سلائیڈوں پر ایک سفید فلم نمودار ہوتی ہے۔ فلم کو تبدیل کرنے کے لیے کلوروفارم میں سلائیڈوں کو کئی بار ہلائیں۔ پتلا اور استعمال کے لیے تیار ہے۔
(2) 0.1 طول بلد پولی-ایل-لائسین (تیار کرنے کے دوران 1 ملی لیٹر فلٹر شدہ پانی میں 1 ملی گرام پولی لائسین کو تحلیل کریں) کو صاف شدہ شیشے کی سلائیڈ پر ڈالیں، اور بوند کے کھلنے کے بعد اسے 450C سپلائی باکس میں ڈالیں۔ . خشک یہ طریقہ بہترین ہے کیونکہ پولی-ایل-لائسین کو مثبت طور پر چارج کیا جاتا ہے، جس سے زیادہ سطح پر منفی چارج شدہ خلیوں کو جوڑنے کی اجازت ملتی ہے۔
(3) گلیسرول پروٹین بنانے کے لیے سلائیڈ کی موٹائی کے لیے آپٹیکل مائکروسکوپ کی ضروریات کے مطابق (30--40) فیصد اور (3-5) فیصد کے تناسب سے آست پانی میں پلازما اور گلیسرول شامل کریں۔ حل مائع کو صاف شدہ شیشے کی سلائیڈ پر گرا دیا جاتا ہے، آپٹیکل مائکروسکوپ کے نیچے کھولا اور خشک کیا جاتا ہے۔ بچھی ہوئی پروٹین فلم کو 2 فیصد گلوٹرالڈہائیڈ میں ڈبو کر پروٹین کو ٹھیک کیا جاتا ہے، بعد میں استعمال کے لیے دھویا اور خشک کیا جاتا ہے۔ استعمال کرنے سے پہلے، پلازما کو پروٹین فلم پر گرا دیا جاتا ہے اسے "فعال" بنائیں، 30 منٹ کے بعد بفر سے دھو لیں، اور اسے براہ راست لگایا جا سکتا ہے۔
فکسڈ اور صاف کیے گئے سیلز کو ڈیجیٹل مائکروسکوپ کے نیچے فلٹر شدہ پانی کے ساتھ سیل سسپنشن کے مناسب ارتکاز میں بنایا جاتا ہے، اور آپٹیکل مائکروسکوپ کو شیشے کی سلائیڈ یا پلاسٹک کی شیٹ پر رکھا جاتا ہے جسے جھلی سے ڈھانپ دیا جاتا ہے، اور اسے مرطوب، کم سطح پر رکھا جاتا ہے۔ درجہ حرارت (40C) ماحول (30-120) منٹ سیلز کو جھلی سے منسلک کرنے کی اجازت دینے کے لیے۔ شیشے کی سلائیڈ کو اٹھانے کے لیے باریک چمٹی کا استعمال کریں اور اسے صاف ڈبل ڈسٹل واٹر میں ہلائیں، اور آپٹیکل مائکروسکوپ سے غیر منسلک خلیوں کو دھو لیں۔ آپٹیکل مائیکروسکوپس میں سلائیڈوں کی موٹائی کے لیے تقاضے پولرائزنگ خوردبین کو پھر تیزی سے 50 فیصد ایسیٹون (یا ایتھنول) سے بھرے برتن میں رکھا جاتا ہے۔ پانی کی کمی کا عمل ہر 3 منٹ میں بڑھتی ہوئی ارتکاز کے ساتھ سلائیڈوں کو ایسیٹون یا ایتھنول میں ڈالنا ہے، اور آپٹیکل مائیکروسکوپ یا شیشے کے سلائیڈ کنٹینر میں ڈی ہائیڈریشن ایجنٹ کے ارتکاز کو مسلسل بڑھانا ہے۔ مصنف کے لیبارٹری کے تجربے کے مطابق، مؤخر الذکر آپریشن زیادہ آسان ہے۔ آپٹیکل مائیکروسکوپی کا مخصوص طریقہ ہر 3 منٹ میں کنٹینر میں پانی کی کمی پیدا کرنے والے ایجنٹ کا نصف حصہ چوس سکتا ہے، اور پھر 100 فیصد کے ارتکاز کے ساتھ پانی کی کمی پیدا کرنے والے ایجنٹ کی مساوی مقدار شامل کر سکتا ہے۔ 5-6 آپریشن کے بعد، مائیکروسکوپ قیمت والے برتن میں پانی کی کمی پیدا کرنے والے ایجنٹ کا ارتکاز 0.5 فیصد سے زیادہ ہو جاتا ہے، اور خلیات کو کامیابی سے پانی کی کمی ہو جاتی ہے۔ نازک نقطہ خشک ہونے کے بعد، شیشے کی سلائیڈ یا پلاسٹک شیٹ کو دھات کی کوٹنگ کے لیے کنڈکٹو چپکنے والی کے ساتھ نمونے کے گھاٹ پر چپکا دیا جاتا ہے۔ تیسرے طریقہ کے ذریعے خلیات کو جھلیوں سے منسلک کرنے کی سہولتیں بھی موجود ہیں۔ آپٹیکل خوردبین "فعال" پروٹین فلم پر گلوٹرالڈہائڈ کے کم ارتکاز سے طے شدہ خلیوں کو لٹکا سکتی ہے۔ آپٹیکل مائیکروسکوپ کے لیے شیشے کی سلائیڈ کی موٹائی کو 10 منٹ کے لیے رکھنے کی ضرورت ہوتی ہے، اور شیشے کی سلائیڈ یا پلاسٹک شیٹ کو 2 فیصد گلوٹرالڈہائیڈ میں بھگو دیا جاتا ہے۔ 30 منٹ کے بعد، فلٹر شدہ ڈبل ڈسٹل واٹر سے دھولیں، اور پھر مذکورہ طریقہ کے مطابق پانی کی کمی، خشک اور دھاتی کوٹ کریں۔
